尿素包合法富集猪油中油酸的工艺优化及降血脂作用

王佳佳，徐慧敏，孟鑫

锦州医科大学食品与健康学院（锦州 121000）

猪油，是最常食用的动物油脂之一，我国拥有丰富的猪油资源，因其含有多种人体必需脂肪酸和高级多烯酸[1]，是一种可供开发利用的优质油脂资源。然而，因猪油中富含饱和脂肪酸，长期食用易引发高血脂、高血压等疾病，常被认为是一种不健康食用油。有研究证明，长期只摄入植物油脂而不摄入动物油脂会食欲不振，伤口不易愈合，增加患糖尿病、贫血和心血管疾病等慢性病风险[2]，猪油与大豆油搭配食用有显著的抗肥胖[3]和降血压的功效[4]。猪油中含量最高的单不饱和脂肪酸——油酸，以甘油酯的形式存在于天然动、植物油中，是人体脂肪组织和血液中丰富的脂肪酸之一[5]。研究表明，在饮食中摄入适量的油酸可以减少由高脂血症引起的心血管疾病发生的概率[6]，有助于维持心脑血管健康[7]。

为此，试验以猪油为原材料，采用尿素包合法对猪油中的油酸进行富集，通过动物试验，考察油酸对高脂血症小鼠血脂代谢的影响，丰富单不饱和脂肪酸资源，为合理利用猪油资源提供新途径，并为进一步解析油酸降血脂机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪油（实验室自制）；氢氧化钠、尿素、95%乙醇、硫酸、无水硫酸钠、正己烷（均为分析纯）；正己烷、甲醇（色谱纯）。

60只雄性昆明小鼠（购于锦州医科大学动物实验中心），体重20～25 g；甘油三酯（TC）试剂盒、总胆固醇（TG）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，南京建成生物研究所；胆固醇、胆酸钠（食品级，佳味源实业有限公司）；猪油（自制）；蛋黄粉（食品级，万邦化工科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

XD-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；HH-2A型恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；GCMS6800气相色谱-质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）；Readmax1900型光吸收全波长酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 油酸富集的工艺优化

称取30 g猪油，加入到一定浓度的氢氧化钠-乙醇溶液中加热回流，回流过程中加入蒸馏水，使皂化液充分溶解，待皂化液冷却后，用20%硫酸调节pH 2～3左右，移入分液漏斗，加入正己烷萃取，萃取液冲洗至中性，加入无水硫酸钠干燥过滤，用旋转蒸发仪旋蒸获得混合脂肪[8]。

将95%乙醇与尿素添加到圆底烧瓶中，在80 ℃水浴锅中加热回流，待尿素全部溶解后，将混合脂肪酸加入其中，加热回流40 min，待混合物冷却到室温，于低温下包合一段时间[9]。包合结束后，迅速抽滤，取出滤液，旋蒸除去乙醇，用硫酸调节pH 2～3，加入正己烷萃取，将有机相调节至中性，用无水硫酸钠干燥过滤，旋蒸后得到包合后的混合脂肪酸[10]。油酸得率按式（1）计算。

1.3.2 响应面优化试验

1.3.2.1 响应面法优化油酸富集工艺

在单因素试验基础上，选取包合时间（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）为考察因素，以油酸得率（Y）为响应值，利用Design-Expert 13软件的试验设计原理，以油酸得率作为评价指标，进行三因素三水平的响应面试验分析，响应面试验因素水平见表1。

表1 油酸富集工艺响应面试验因子水平及编码

1.3.2.2 脂肪酸甲酯化

取50 mg脂肪酸，加入5 mL正己烷，溶解后加入0.8 mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液，于30 ℃水浴15 min，经无水硫酸钠干燥后，吸取上清液，经0.22 μm滤膜过滤，进样分析。

1.3.2.3 GC-MS条件

色谱柱为J&W DB-5石英毛细柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升温程序：初始温度150 ℃，持续1 min，以5 ℃/min升温至210 ℃，持续3 min，以5 ℃/min升至250 ℃；流速1 mL/min；分流比10∶1，高纯氦为载气。电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃。脂肪酸相对含量由峰面积相对归一法确定。

1.3.3 油酸对高脂血症小鼠血脂代谢的影响

1.3.3.1 试验小鼠分组

60只昆明小鼠（SPF级）饲养在恒温24 ℃环境中，每组10只，随机分为6组。适应性喂养1周后，1组作为空白对照组饲喂基础饲料，其他5组均饲喂高脂饲料（70%基础饲料、15%猪油、10%蛋黄粉、3%胆固醇和2%胆酸钠），饲喂4周后，采血获得血清，检测血脂水平，判断高脂血症模型建立是否成功。模型建造成功后，继续高脂饲料饲喂，高脂模型组仅饲喂高脂饲料，低、中、高剂量油酸组每天分别灌胃2，4和8 g/kg油酸，阳性药物组灌胃5 mg/kg辛伐他汀，连续灌胃4周。此期间小鼠自由饮食饮水直至灌胃结束。

1.3.3.2 小鼠指标的检测

灌胃结束后，所有小鼠禁食不禁水24 h，采血，静置2 h后，按6 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，于-20 ℃保存。检测血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.3.3.3 小鼠肝脏组织切片观察

小鼠肝脏组织经多聚甲醛固定后，采用苏木-伊红染色后，通过荧光显微镜观察小鼠肝组织病理变化。

1.3.4 数据处理

采用Excel、SPSS 26.0、Design Expert 13数据分析软件对数据进行统计分析并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果与分析

2.1.1 模型建立与数据分析

结合单因素试验的结果，依据Design-Expert 13软件的试验设计原理，以油酸得率（Y）为响应值，包合时间（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）为自变量，设计三因素三水平Box-Behnken中心组合试验，试验设计方案及结果见表2，对试验数据进行多元回归拟合，进行通过回归分析，得到各因素与油酸得率方程式：油酸得率=55.85-2.48A-1.95B-0.450 0AB-0.742 5AC+2.04BC-5.68A2-4.10B2-5.06C2。

表2 响应面试验设计及结果

方差分析结果如表3所示。该二次方程模型方差分析模型显著（P＜0.05），失拟项P值为0.847 0，不显著，证明该方程与试验的失拟较小，结果能够较好反映出试验的真实性。由F值可知，各因素对油酸得率影响次序为B＞A＞C。根据Design Expert 13给出的回归方程，得出油酸富集的最佳工艺条件：包合时间8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1。在此条件下，油酸最大得率53.28%。

表3 回归模型方差分析

2.1.2 响应面分析

响应面线图能直接反映两因素交互影响的程度，2个因素之间交互作用越显著，曲面图变化幅度越大。油酸得率A、B、C之间两两交互作用的响应面分析如图1所示。与P值相结合可得，两两因素交互作用显著程度顺序为BC＞AC＞AB。

图1 响应面交互作用分析图

2.2 油酸对高脂血症小鼠的血脂代谢影响

2.2.1 油酸对高脂血症小鼠血脂代谢的影响

由图2可知，高脂模型组小鼠血清中HDL-C含量极显著低于空白组（P＜0.01），而TC、TG、LDL-C水平极显著高于空白组（P＜0.01）。低、中、高灌胃剂量组TG、TC、LDL-C均有不同程度降低且呈现剂量-依赖性下降，3组均与模型组有极显著差异（P＜0.01）。油酸低、中剂量组HDL-C含量极显著高于高脂模型组（P＜0.01），高剂量组HDL-C水平略微低于中剂量组，但仍显著高于高脂模型组。

图2 油酸对小鼠血脂代谢影响

试验结果表明，油酸能够降低高脂血症小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，从而改善高脂血症小鼠的血脂代谢异常，对高脂食物诱导的代谢综合征有一定治疗作用，可以在降血脂方面提供新的选择，并为进一步研究油酸的降血脂机制提供方向。

2.2.2 油酸对高脂血症小鼠肝脏组织的影响

对各组小鼠的肝脏切片观察结果见图3。空白组小鼠肝脏组织细胞形态正常，结构清晰，未见脂肪空泡；高脂模型组小鼠肝脏组织细胞排列混乱，可见大滴脂肪空泡，脂肪化程度较高。药物阳性对照组切片未见脂肪空泡，细胞排列整齐。与模型组相比，低中剂量组，脂肪空泡数量逐渐减少，偶可见较小脂滴，脂肪化程度减小；高剂量组改善效果尤为明显，细胞边界清晰，排列整齐，未见脂肪空泡，肝细胞基本恢复正常，与阳性药物对照组接近。

图3 小鼠肝脏组织HE染色切片观察结果（200×）

试验证明肝脏病变程度随油酸剂量增大而减小，油酸对高脂血症小鼠肝脏具有一定保护作用，可以减小肝脏的病变程度。

3 结论

以猪油为原料，采用尿素包合法对猪油中的油酸进行富集，通过单因素试验和响应面法相结合探究包合时间、脲脂比、醇脲比对油酸富集结果的影响。油酸富集最佳工艺条件为包合时间8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1，油酸得率最大（53.28%）。将优化工艺获得的油酸饲喂高脂血症小鼠，能够显著降低高脂血症小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，对饮食引起的血脂增高有较好的改善作用，对高脂血症具有一定预防作用，可作为一种优质的具有降血脂功能的食品资源，为进一步拓展猪油在食品加工中应用奠定基础。