双频超声波处理对蛋白酶活性的影响

何灵芝，简显瑀，王达川，金建

1.四川保宁醋有限公司（阆中 637400）；2.西南科技大学生命科学与工程学院（绵阳 621000）

酱油因其特有的风味和营养价值受到全球人民的追捧[1]。我国的酱油生产历史十分悠久，国内主要在生产工艺优化[2-3]与新型原材料开发利用[4]、智能监控酱油发酵[5-6]、优良米曲霉菌株选育[7]和多菌种协同作用改善风味[8-9]等方面探索酱油酿造的新方向。

酱油发酵过程中由米曲霉产生的蛋白酶能有效分解原料中的蛋白质大分子，使酱油中的营养物质更易被人体吸收，同时赋予酱油其独特的风味并保证酱油的品质[10-11]。提高酶活性可以加速物质的转化，国内外开展了一系列处理技术的研究，如超声波处理[12]、强电场处理[13]、辐照处理[14]、高压处理[15]和化学试剂处理[16]。超声波作为一项新兴的物理加工处理技术，相对安全、操作简单、经济环保，被广泛运用于活性产物辅助提取[17-18]和食品加工[19]。荆卉等[20]阐述了超声波的物理、化学效应以及蛋白质改性相关方面的研究进展。Tra等[21]研究发现，优化超声波处理条件后，α-淀粉酶活性可提高47%，在一定程度上为米曲霉所产蛋白酶的超声波处理提供了借鉴。

酱油生产工艺分为低盐固态发酵和高盐稀态发酵。在稀态发酵过程中，若采用新型物理加工技术，可缩短酱油发酵周期和提高原料利用率。因此，试验探讨低强度双频超声波处理对米曲霉代谢产生的蛋白酶活性影响，为新技术在传统发酵食品中的应用提供一定借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉、麸皮、豆粕（四川保宁醋有限公司）；福林酚（生化试剂，上海蓝季科技发展有限公司）；三氯乙酸，分析纯，福晨（天津）化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，成都金山化学试剂有限公司。

HH-8数显恒温水浴锅（常州市金坛华特实验仪器有限责任公司）；KH-300SP双频数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器股份有限公司）；Centrifuge 5425R德国艾本德高速冷冻离心机（艾本德中国有限公司）；HZQ-160F全温振荡培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；V-5600（PC）紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 米曲霉蛋白酶粗酶液的制备与提取

1.2.1.1 米曲霉的培养

制备PDA培养基，灭菌后趁热倒平板。称取0.1 g米曲霉菌粉于100 mL灭菌生理盐水中，在无菌环境中振荡20 min使之混合均匀，用移液枪吸取1 mL米曲霉液于9 mL生理盐水的试管中，振荡混合均匀后，重复上述操作步骤按梯度稀释。取0.1 mL最终稀释米曲霉酶液，用灭菌后的涂布器均匀涂抹平板，在30 ℃恒温条件下倒置培养3 d。

1.2.1.2 孢子悬浮液的制备

用100 mL在121 ℃下灭菌20 min的生理盐水将平板上的成熟米曲霉孢子洗脱，并用灭菌脱脂棉进行过滤，从而除去洗脱液中的菌丝体，将孢子悬浮液装入无菌锥形瓶中，振荡20 min使之达到混合均匀的效果。

1.2.1.3 米曲霉的摇瓶培养

取2 mL米曲霉孢子悬浮液入灭菌后的麸皮豆粕培养基中，在28 ℃恒温条件下培养4 d并每隔16 h抖动锥形瓶进行1次翻曲[22]。

1.2.1.4 蛋白酶粗酶液的提取

取100 mL磷酸缓冲液于麸皮豆粕培养基中，在40℃下恒温水浴搅拌1 h，用滤纸过滤，并在4 000 r/min条件下离心20 min，取其上清液，即为米曲霉产生的蛋白酶粗酶液。

1.2.2 蛋白酶活力的测定

1.2.2.1 蛋白酶活力单位的定义

蛋白酶在pH 7.5和温度40 ℃条件下，1 min内水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，用U表示。

1.2.2.2 蛋白酶活力的测定

移取1 mL蛋白酶液于试管中，在40 ℃下恒温水浴5 min，加入2 mL质量分数2%的酪蛋白溶液，混匀并在40 ℃下恒温水浴反应15 min，加入3 mL 10%三氯乙酸，室温静置20 min后以4 500 r/min离心20 min（4℃）。吸取1 mL上清液，加入5 mL 0.55 mol/L碳酸钠溶液和0.5 mL福林酚试剂，在40 ℃下恒温水浴20 min显色，并在波长680 nm处测定吸光度。

1.2.2.3 蛋白酶活力计算

蛋白酶活力按式（1）计算。

式中：X为蛋白酶活力，U/mL；A为试验组的吸光度；A0为空白对照的吸光度；0.002 9为标准曲线截距；0.010 4为标准曲线斜率；15为酶解反应时间，min；n为粗酶液稀释的倍数。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 超声波处理时间对蛋白酶酶活的影响

取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）。固定超声处理温度20 ℃、25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声功率密度50 W/L，分别超声处理0，5，10，15，20和30 min，处理结束后，取1 mL酶液测定酶活。每个水平重复3次试验，每次重复平行测定3次酶活。

1.2.3.2 超声功率密度对蛋白酶酶活的影响

取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）。固定25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声处理温度20 ℃，分别在超声波功率密度25，50，100，125和150 W/L下处理10 min。其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 超声波处理介质温度对蛋白酶酶活的影响

取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）。固定25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声功率密度25 W/L，分别在介质温度15，20，25，30和40 ℃下超声波处理10 min。其余操作同1.2.3.1。

对照组（恒温水浴）：取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5），在恒温（15，20，25，30和40 ℃）水浴下保温10 min。

1.2.3.4 双频超声波工作时间比对蛋白酶酶活的影响

取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）。固定超声温度25 ℃、超声功率密度25 W/L，分别在25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50，10∶20，20∶30，10∶10，30∶20，20∶10（s/s）的参数下处理10 min。其余操作同1.2.3.1。

1.2.4 正交试验设计

基于超声处理各个单因素试验结果，选取单因素的优水平及相邻的2个水平，按照L9(34)正交表对超声处理工艺参数进行试验，因素与相关水平见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

1.2.5 最佳超声波处理工艺验证

试验组：取50 mL酶液于500 mL烧杯中，加入200 mL磷酸缓冲液（pH 7.5）。设定超声波处理温度20 ℃、超声功率密度25 W/L、25 kHz与40 kHz超声波工作时间比20∶30（s/s），处理10 min后，取1 mL酶液，测定吸光度并计算酶液的酶活力。

对照组以恒温水浴代替超声波处理。处理结束后，分别取1 mL酶液，按照酶活力的测定步骤进行操作，测定吸光度并计算酶液的酶活力。

1.2.6 数据处理与分析

所有试验均重复3次，每次重复平行测定3次。数据处理与图形绘制采用Excel软件，结果用“平均值±标准差”表示，统计检验设定显著性水平α=0.05（n=9）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声波处理时间对蛋白酶活性的影响

固定超声处理温度20 ℃、25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声功率密度50 W/L，超声波处理时间对蛋白酶活性的影响见图1。

图1 超声波处理时间对蛋白酶活性的影响

随着超声波处理时间的延长，蛋白酶活性先增强后逐渐减弱。超声波处理时间10 min时，酶活性到达最大值。超声波空化效应引起的综合作用，如局部高温高压、微射流和剪切力等会导致蛋白酶催化活性中心暴露，进而酶活性增强[12]。然而，长时间的超声波处理可导致蛋白酶的变性，从而酶活性减弱[23]。

2.1.2 超声波功率密度对蛋白酶活性的影响

固定超声处理温度20 ℃、25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声处理时间10 min，超声波功率密度对蛋白酶活性的影响见图2。

图2 超声波功率密度对蛋白酶活性的影响

随着超声波处理功率密度的增大，蛋白酶活性先增强后逐渐减弱，超声波功率密度25 W/L时，酶活性达到最大值。超声功率密度增大，超声波引起的空化效应足以使蛋白酶空间构象发生变化，有利于酶与底物接触，从而发挥催化作用，故而酶活性加强。然而，随着超声波处理功率密度继续增大，蛋白酶的空间构象朝着不利于催化的方向变化，或者酶分子发生变性，活性丧失，酶活减弱[20,24]。

2.1.3 超声波处理介质温度对蛋白酶活性的影响

固定超声波处理功率密度25 W/L、25 kHz与40 kHz超声工作时间比10∶50（s/s）、超声处理时间10 min，超声波处理介质温度对米曲霉产的蛋白酶活性的影响见图3。

图3 超声波处理介质温度对蛋白酶活性的影响

在相同温度条件下，恒温水浴下的蛋白酶活性随温度升高而增强，在恒温水浴30 ℃条件下，蛋白酶活性趋于稳定[25-26]。与恒温水浴处理相比，相同介质温度下，超声波处理后的酶活性先增强后逐渐减弱，超声波处理温度25 ℃时，蛋白酶活性最强且高于恒温水浴处理下的酶活性。超声波处理温度低于25 ℃时，液体温度越高，对空化效应的产生越有利，蛋白酶空间构象的变化越明显，有利于酶与底物接触，故而酶活性加强。但当超声波处理温度高于25 ℃且温度逐步上升时，液体气泡中蒸汽压增大，因此气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化效应减弱[27]，蛋白酶空间构象的变化减小，故而酶活性减弱。

2.1.4 双频超声波工作时间比对蛋白酶活性的影响

固定超声波处理功率密度25 W/L、超声处理时间10 min、超声波处理温度25 ℃，双频率超声波工作时间比对蛋白酶活性的影响见图4。

图4 双频超声波工作时间比对蛋白酶活性的影响

25 kHz与40 kHz超声工作时间比20∶30（s/s）处理蛋白酶活性高且稳定，蛋白酶活性随着25 kHz频率超声波时间占比的增加大体上符合先增强后逐渐减弱的趋势。超声波频率越低，在液体中产生空化越容易[28]。频率越高，空化气泡越小，空化强度越弱[29]。随着25 kHz超声波时间占比的增加，空化强度增大[30]，蛋白酶空间构象的变化越明显，故而酶活性加强。但当25 kHz超声波时间占比继续增大时，空化效应产生的大气泡更易形成表面振荡，小空化泡的非球形扰动主要发生在崩溃阶段，易促使空化泡溃灭[31-32]，从而降低空化强度，蛋白酶空间构象的变化减弱，故而酶活性减弱。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表2。各因素对蛋白酶活性的影响效果由大到小依次排序为超声温度（A）＞工作时间比（C）＞超声时间（B）。直观分析得出的最优组合为A1B2C2，即超声波处理温度20 ℃，超声波处理时间10 min，25 kHz与40 kHz超声波工作时间比20∶30（s/s）。

表2 正交试验结果

正交试验各因素方差分析结果见表3。结果表明，超声波处理温度对蛋白酶活性影响极显著（P＜0.01），25 kHz与40 kHz超声波工作时间比对蛋白酶活性影响显著（P＜0.05），超声波处理时间对蛋白酶活性影响不显著（P＞0.05）。

表3 正交试验方差分析结果

2.3 最佳工艺验证结果

由图5可知，基于最优工艺参数[超声波处理温度20 ℃、功率密度25 W/L、处理时间10 min、25 kHz与40 kHz超声波工作时间比20∶30（s/s）]处理下的蛋白酶，其活性较对照组的提高了5.68%，表明适当的超声波处理可以提高蛋白酶的活性，这可能与超声波的空化效应引起酶分子空间构象的变化有关[33]。

图5 最佳超声波处理与未超声处理对照试验结果

3 结论

蛋白酶分解蛋白质产生氨基酸和多肽是酱油酿造过程中的重要环节。以蛋白酶活力为评价指标，探讨双频超声波处理蛋白酶提高活性的工艺条件，经单因素试验和正交试验确定出双频超声波处理的最优工艺参数，即超声温度20 ℃、超声时间10 min、超声功率密度25 W/L、5 kHz与40 kHz超声波工作时间比20∶30（s/s），其活性较未经超声波处理的对照组提高了5.68%。试验结果表明双频超声波对蛋白酶的酶解有促进作用，说明超声波处理是提升蛋白酶活性的一种有效途径，可为酱油酿造传统工艺现代化提供参考借鉴。