华通胶修饰的聚己内酯静电纺丝人工血管支架的构建及性能分析

何芳玲, 蒋廷波

血管移植术在治疗心血管疾病方面应用广泛,包括冠状动脉旁路移植、血液透析以及糖尿病下肢血管病变等[1]。然而,有限性的自体血管供体严重制约了其临床应用,且目前尚无小口径人工血管的商业产品在临床应用,而小口径人工血管移植的高再狭窄率也是当前亟须解决的难题[2-3]。人工血管材料普遍存在血液相容性较差、血管堵塞率高、与自体血管顺应性不匹配等问题[4]。因此,制备综合性能优良的小口径可降解人工血管成为当前研究的热点。脐带作为一种非病理性可获取的组织,是组织工程中理想的天然材料之一[5]。华通胶(Wharton′s jelly,WJ)是脐带血管周围的黏液结缔组织,含有多种类型的胶原蛋白和黏多糖,以及由间充质干细胞合成的生长因子和(或)细胞因子,因此可视为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的天然来源[6]。WJ富含胶原蛋白、透明质酸等基质,具有支架所需的许多独特的生化特性,是制备人工血管支架的理想天然材料,但WJ基质力学强度较差,且单独应用无法进行静电纺丝。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)是一种生物降解性聚合物,在生物医学和材料科学领域广泛应用。使用静电纺丝技术制备的PCL纤维具有力学性能、生物相容性、可调性、可控性良好以及高比表面积等优点。本研究采用脱细胞技术解离出WJ基质,经与PCL复合后采用静电纺丝技术制备出具有典型纳米纤维结构、完好生物力学特性、理想血液相容性以及能有效抑制血小板沉积的WJ/PCL静电纺丝人工血管支架,现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 新鲜脐带组织由复旦大学附属妇产科医院捐赠,共10条,来源于20～30岁健康产妇,捐赠者知情同意。研究获苏州大学附属第一医院伦理委员会批准(批号SUDA20210711A06)。胰蛋白酶、六氟异丙醇、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM培养基购自美国Sigma-Aldrich公司。H&E染色试剂盒、DAPI染色试剂盒、Safranin-O染色试剂盒、Toluidine blue染色试剂盒、Sirius red染色试剂盒、Alcian blue染色试剂盒、DNA定量试剂盒、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)定量试剂盒、羟脯氨酸定量试剂盒和活性因子酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自Yeasen公司(中国上海)。

1.2脱细胞WJ基质的制备 收集脐带,于清水下将残留血迹冲洗干净,浸泡于75%酒精30 min。超净台紫外线照射30 min,实验器械提前灭菌。铺上无菌巾,用剪刀将脐带组织沿着血管裁开,用有齿镊以适当力度紧钳住血管(两条动脉、一条静脉)两侧壁,确保血管剥离干净,然后多次反复剥离脐带外膜组织,直至完全去除干净。使用无菌手术剪将分离的WJ切成0.5 cm的小块,然后将WJ置于0.025%胰蛋白酶中(WJ与胰蛋白酶的比例为1 g∶5 mL),37 ℃下用磁力搅拌器搅拌消化24 h。将搅拌的悬浮液以16 000 g条件离心10 min,100 μm过滤器过滤,收集上清液。加入10% FBS以抑制胰蛋白酶反应,并将所得的WJ基质存贮在PBS中,4 ℃下保存备用。

1.3WJ基质脱细胞前后生化成分检测 将脱细胞前后的WJ基质标本置于4%的多聚甲醛中固定24 h,行梯度酒精脱水、石蜡包埋,并切成5 μm厚度的组织切片。通过H&E染色观察标本的胶原纤维以及细胞核,DAPI染色验证标本的细胞核成分,Safranin-O染色评价标本的GAG成分,Toluidine blue染色检测标本的蛋白质成分,Sirius red染色评价标本的纤维成分,Alcian blue染色检测标本的透明质酸成分。将脱细胞前后的WJ基质标本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h,采用DNA定量试剂盒检测标本中的DNA含量,并应用GAG定量试剂盒检测标本中的GAG含量,采用羟脯氨酸定量试剂盒测定标本中的羟脯氨酸含量。

1.4WJ基质脱细胞前后生物活性因子含量测定 将WJ基质脱细胞前后的标本置于木瓜蛋白酶溶液中消化12 h后收集提取物,应用ELISA法测定血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)。实验操作严格按照试剂盒说明书进行,重复3次独立实验。

1.5PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架制备

将PCL和WJ/PCL(重量比为50∶50)混合物溶解于六氟异丙醇中,调节溶液浓度为12%(质量/体积比),磁力搅拌器恒定搅拌24 h,使之完全溶解,得到PCL和WJ/PCL纺丝液。应用21G医用金属注射器作为喷丝器,将注射器的针头拧紧后将体部夹于精确注射器泵上。调节设置静电纺丝仪的参数,高压电源设置为15 kV,注射泵层流速度设置为1.0 mL/h,室温调为25 ℃,环境湿度为40%～50%,纺丝时间为3～6 h。使用铝箔(150 mm×150 mm)接地接收,调整接收距离为12 cm,启动设备开始静电纺丝过程。静电纺丝完成后将样本小心地取下,放置于真空室中进行通风48 h,挥发去除有机溶剂残留,并在50 mL PBS中加入48 mL碳化二亚胺盐酸盐(carbodiimide hydrochloride,EDC)溶液和6 mL N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)(pH=5.5)处理;在-4 ℃条件下放置24 h达到充分交联。然后在去离子水中冲洗纳米电纺支架,去除未反应的EDC和NHS,并置于真空冷冻干燥机中冻干以备后续使用。

1.6PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的理化性能表征 首先采用单反相机进行拍摄。随后其纳米纤维的表面形态和尺寸可直接在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察,并通过Image J软件分析其纤维直径分布。另外,通过傅立叶红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR)检测PCL、WJ和WJ/PCL样本的化学成分构成。

1.7力学性能检测 通过对PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架施加压缩载荷来评估其单轴机械性能。将PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架切割成统一大小(4 cm×1 cm,n=4),夹子固定支架的两端,使用材料测试机(HY-940FS,恒宇仪器有限公司,中国上海)以10 mm/min的压缩速度进行机械性能测试,从而测定压缩应力-应变曲线、极限拉伸应力和断裂拉伸率。

1.8溶血实验 将从兔颈动脉提取的动脉血与PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架共混进行直接溶血实验。分为PCL组和WJ/PCL组、阳性对照组(水)和阴性对照组(PBS)四组,每组重复3次独立实验。其中PCL组为4 mL血液+10 mL PBS+PCL支架共混;WJ/PCL组为4 mL血液+10 mL PBS+WJ/PCL支架共混;阳性对照组为4 mL血液+10 mL水共混;阴性对照组为4 mL血液+10 mL PBS共混。应用分光光度计在545 nm波长处检测吸光度值。

1.9血小板黏附实验 采集兔新鲜的血液样品,离心分离血小板,获取血小板悬液。将1 mL的血小板悬液分配到96孔微孔板中,并置于恒温、恒湿的培养箱中进行孵育,允许血小板分别直接与PCL和WJ/PCL支架进行黏附。借助显微镜进行血小板计数。通过计数器或格点计数法计数样本中的血小板数目,即可得到每平方毫米面积的血小板数量。血小板黏附量=视野中血小板数量×视野面积/样品总面积。

2 结果

2.1WJ脱细胞处理有效性验证 WJ基质经过脱细胞处理后略有溶胀(见图1a1、b1)。H&E染色显示,脱细胞后的WJ基质基本无细胞核成分(见图1a2、b2)。DAPI染色也显示脱细胞后的WJ基质基本无蓝色深染的细胞核成分(见图1a3、b3)。DNA定量检测结果表明脱细胞处理后WJ基质DNA含量显著降低[(0.94±0.39)ng/mg vs(14.42±1.09)ng/mg;t=23.320,P=0.001],见图1c。

a1、b1.WJ基质脱细胞处理前后的大体照片;a2、b2.WJ基质脱细胞处理前后的H&E染色照片;a3、b3.WJ基质脱细胞处理前后的DAPI染色照片;c.WJ基质脱细胞处理前后的DNA含量比较,*P<0.05

a1、b1.WJ基质脱细胞处理前后的Safranin-O染色照片;a2、b2.WJ基质脱细胞处理前后的Toluidine blue染色照片;a3、b3.WJ基质脱细胞处理前后的Sirius red染色照片;a4、b4.WJ基质脱细胞处理前后的Alcian blue染色照片;c.WJ基质脱细胞处理前后的GAG水平比较;d.WJ脱细胞处理前后的羟脯氨酸水平比较,*P<0.05

2.2WJ脱细胞处理前后的生化成分变化分析结果

Safranin-O染色结果显示,WJ基质脱细胞前后均有大量红色阳性深染的GAG成分(见图2a1、b1)。Toluidine blue染色结果显示,WJ基质脱细胞前后均有大量蓝色阳性深染的蛋白质成分(见图2a2、b2)。Sirius red染色结果显示,WJ基质脱细胞前后均有大量橙红色阳性深染的纤维成分(见图2a3、b3)。Alcian blue染色结果显示,WJ基质脱细胞前后均有大量阳性浅蓝色的透明质酸成分(见图2a4、b4)。WJ基质在脱细胞处理后GAG[(8.49±0.88)μg/mg vs (11.47±0.90)μg/mg;t=4.754,P=0.001]和羟脯氨酸[(48.53±4.59)μg/mg vs (58.23±5.83)μg/mg;t=2.614,P=0.031]含量显著降低,见图2c、d。

2.3WJ脱细胞处理前后的活性因子变化分析结果

WJ基质脱细胞处理前后VEGF水平比较差异无统计学意义(P>0.05),见图3ⓐ。WJ基质脱细胞处理后PDGF、TGF-β1、FGF-2水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图3ⓑ～ⓓ。

ⓐWJ基质脱细胞处理前后VEGF水平比较:(1.14±0.09)ng/μg vs (0.97±0.14)ng/μg;t=2.068,P=0.072。ⓑWJ基质脱细胞处理前后PDGF水平比较:(0.70±0.08)ng/μg vs (0.56±0.07)ng/μg;t=2.752,P=0.025。ⓒWJ基质脱细胞处理前后TGF-β1水平比较:(0.18±0.03)ng/μg vs (0.12±0.02)ng/μg;t=3.313,P=0.011。ⓓWJ基质脱细胞处理前后FGF-2水平比较:(0.19±0.04)ng/μg vs (0.13±0.03)ng/μg;t=2.952,P=0.018。*P<0.05,ns为P>0.05

2.4WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的制备结果

PCL(见图4a1、a2)和WJ/PCL(见图4b1、b2)静电纺丝人工血管支架均具有典型的管状结构,外观呈白色纤维样,与天然血管的大体观类似。SEM显微照片显示,PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架均具有明显的纳米纤维结构(见图4a3、b3)。PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管具有相似的纤维直径分布,集中在0.1～1.0 μm(见图4c、d)。FTIR检测结果显示,PCL的特征峰出现在1 738 cm-1和2 973 cm-1,WJ的特征峰出现在1 432 cm-1和1 489 cm-1,而WJ/PCL同时出现了PCL和WJ的特征峰,说明在WJ/PCL静电纺丝人工血管支架中同时存在WJ和PCL成分,见图4e。

a1、a2.PCL静电纺丝人工血管支架的大体照片,其中a1为俯视图,a2为侧视图;b1、b2.WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的大体照片,其中b1为俯视图,b2为侧视图;a3.PCL静电纺丝人工血管支架的SEM照片;b3.WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的SEM照片;c.PCL静电纺丝人工血管支架的纤维直径分布;d.WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的纤维直径分布;e.WJ/PCL、WJ和PCL的FTIR分析图谱,其中红色箭头指示PCL的特征峰,黑色箭头指示WJ的特征峰

2.5WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的生物力学分析结果 随着压缩应变的增加,PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的压缩应力均显著上升,但是PCL组上升趋势明显高于WJ/PCL组(见图5ⓐ)。极限拉伸应力定量分析结果显示,PCL组极限拉伸应力高于WJ/PCL组[(7.22±0.53)MPa vs (6.20±0.32)MPa;t=3.285,P=0.011],见图5ⓑ。PCL组断裂拉伸率低于WJ/PCL组[(71.22±5.11)% vs (86.40±2.19)%;t=5.461,P=0.001],见图5ⓒ。

ⓐPCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的压缩力学曲线图;ⓑPCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的极限拉伸应力比较;ⓒPCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的断裂拉伸率比较。*P<0.05

2.6WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的溶血性分析结果 将血液分别与水、PCL静电纺丝人工血管支架、WJ/PCL静电纺丝人工血管支架和PBS共孵育30 min,结果显示水和PCL静电纺丝人工血管支架均出现溶血现象,而WJ/PCL静电纺丝人工血管支架和PBS均未出现溶血现象,见图6ⓐ。定量分析结果表明,阳性对照组和PCL组的545 nm处的吸光度值显著高于WJ/PCL组和阴性对照组,见图6ⓑ。

ⓐ血液分别与水、PCL静电纺丝人工血管支架、WJ/PCL静电纺丝人工血管支架和PBS共孵育30 min的大体照片;ⓑ四组共孵育30 min后545 nm处的吸光度值比较,*P<0.05,ns为P>0.05

2.7WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的血小板沉积性能分析结果 PCL组的血小板沉积量高于WJ/PCL组[(35 684±1 360)血小板/mm2vs (5 726±753)血小板/mm2;t=38.530,P<0.001],见图7。

图7 PCL和WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的血小板沉积水平比较图(*P<0.05)

3 讨论

3.1在临床中,理想的血管修复重建方法应能及时修复血管、恢复血运,并在体内形成自体血管,从而保持长期通畅。组织工程技术提供了实现小血管修复的理想途径[7]。如何制备综合性能优良的小口径可降解人工血管是当前研究的热点和亟须解决的难题。近年来,联合使用天然材料和合成材料制备血管支架是一种全新、切实可行的思路[8]。

3.2ECM是血管组织中的主要成分,含有大量直径在几十到几百纳米之间的纳米纤维[9]。近年来,天然来源的ECM得到了广泛的研究[10-12]。作为一种新型的、从健康人类WJ提取的完整ECM,WJ基质含有大量有利于血管再生的生化成分和生物活性因子[13]。WJ富含胶原蛋白、透明质酸等基质,具有支架所需的许多独特的生化特性。此外,WJ是肽类生长因子的丰富来源,尤其是VEGF、PDGF、TGF-β1和FGF-2,都与调控细胞增殖、分化、合成和ECM重塑有关[14]。因此,WJ基质是制备人工血管支架的理想天然材料。

3.3本研究提出使用WJ基质制备可仿生天然ECM微环境的人工血管支架。然而从人体组织中提取的ECM在恢复其所有功能成分方面可能具有挑战性。通常采用机械、化学和酶法来分离ECM。本研究选择使用酶法分离完整的ECM,以简化分离过程,更重要的是,可使ECM含有组织保持在相对生理状态。结果显示,基于胰蛋白酶对WJ进行脱细胞处理,可在充分去除细胞核成分的同时有效保留天然WJ基质的生物活性分子,包括VEGF、PDGF、TGF-β1、FGF-2等,在维持血管功能中具有重要意义[15]。这些生物活性因子载入WJ/PCL静电纺丝纳米纤维后会缓慢释放,未来研究将进一步探索其缓释曲线,并在体内应用于修复血管组织,以验证其维持血管功能的实际功效。

3.4在众多合成材料中,PCL具有化学结构多样、生物相容性好、降解可控、易加工、力学可调等优越特性[16]。通过3D打印、共轭纺纱、熔喷纺丝、双螺杆挤出、发泡成型等技术,可以加工成各种形状[17]。此外,PCL纤维还具有合理的孔径和孔隙率,其仿生ECM的三维结构能增强内皮细胞在支架上的黏附、延伸和扩散,加速内皮化过程。有研究表明,PCL可以通过静电纺丝技术制备成规整的纳米纤维[18]。因此,PCL纳米纤维是构建人工血管的理想材料来源。

3.5静电纺丝技术具有特殊的性能,在利用高压静电场的驱动下,能够将符合目标组织生物、物理和化学需求的聚合物溶液瞬间拉成纤维,并使纤维固化沉积到纤维收集器上,从而制作纳米级的组织工程复合型支架[19]。通过静电纺丝制备的组织工程支架形态结构与天然ECM结构相似,纳米纤维表面积与体积比高,孔径分布广泛,孔隙率适宜,形象具有可控性,力学性能可调,从而更好地模拟天然ECM[20]。这些物理特性将促进种植细胞产生良好的生物反应,包括增强细胞黏附、增殖和分化,有利于营养物质的渗透和运输,促进细胞间交流和有效的细胞应答等[21]。此外,静电纺丝技术具有工艺简单、设备易得、制造成本较低、适用的材料种类多、工艺技术可控性强等优点,已成为制备纳米纤维的主要方法之一[22]。综上,静电纺丝技术有望在血管组织工程中发挥重要作用。

3.6人工血管支架在血管再生中扮演着重要的生物力学、血液相容性和抑制血小板沉积角色。人工血管支架的生物力学对于血管再生的意义包括:(1)支撑和稳定性。(2)优化血流动力学。(3)促进内皮化和血管再生。优秀的生物力学性能对于人工血管的设计和制备至关重要,可直接影响人工血管在体内的功能和耐用性,从而提高手术成功率并改善患者生活质量[23]。此外,人工血管支架的溶血性对于血管重建意义重大[24],选择溶血性较低的支架材料有助于避免溶血反应,维持良好的血流,提高细胞相容性,并降低并发症风险,从而促进血管重建的成功。血小板是血液中的一种细胞,其主要功能是参与止血和血栓形成。在人工血管中,抑制血小板沉积的能力对于防止血栓形成、减少血管堵塞和保持血流畅通具有重要意义[25]。PCL静电纺丝具有足够的力学强度,适用于人工血管支架。本研究中WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的力学性能较单纯PCL略低,可用于人工血管重建。此外,在溶血性评估试验中,相较于水和PCL,WJ/PCL静电纺丝人工血管支架具有与PBS同等的吸光度数值,表明其有良好的血液相容性。定量分析结果也显示,相较于PCL,WJ/PCL静电纺丝人工血管支架的血小板沉积数量极低,证明其可有效抑制血小板黏附。这些良好的特质为其后续用于血管重建提供了坚实的基础。

3.7WJ/PCL静电纺丝人工血管抑制溶血性的机制主要有以下几个方面:(1)WJ具有良好的细胞相容性,能够与周围的生物组织相容,减少异物反应和炎症反应。在支架材料与患者的血液和细胞相互作用时,减少细胞破裂和溶血现象的发生。(2)WJ在体内不易被免疫系统识别为异物,不会引发强烈的免疫反应,进而降低了溶血反应的风险。(3)WJ/PCL静电纺丝人工血管稳定且致密的物理结构减少了血管内红细胞破裂和血红蛋白释放,从而降低了溶血性。(4)WJ含有一些生物活性物质,有助于促进细胞的生长和修复,从而减少细胞破裂和溶血现象[26]。

综上所述,本研究采用胰蛋白酶法对WJ基质进行脱细胞处理后可以有效去除WJ的细胞核成分,并保留WJ基质的绝大部分生化成分以及生物活性因子。通过静电纺丝技术成功制备具有典型纳米纤维结构的WJ/PCL静电纺丝人工血管支架,具有良好的生物力学特性、血液相容性和抑制血小板黏附能力,为血管重建提供了一种极具应用前景的人工血管支架选择。