两种高黎贡山附生兰的种子表面灭菌及生活力测定研究*

李村富,浦秀丽,李春芳,蒋宏,何俊

(1.中国科学院昆明植物研究所 中国西南野生生物种质资源库,云南 昆明 650201;2.云南省林业和草原科学院,云南 昆明 650201)

兰科(Orchidaceae)是被子植物中的最大科之一,全世界记录约有736属28 000多种[1],部分物种具有重要的观赏、药用、食用、科研和文化等价值,备受人们关注[2-3]。近年来其野生植物资源遭到过度采集,在自然条件下种子萌发又依赖真菌等因素导致兰科植物成为植物保育中的“旗舰”类群[4]。在最新颁布的《国家重点保护野生植物名录》(2021年)收录的1 101种野生植物中,兰科植物占比近约1/3[5]。兰科植物种子小如“粉尘”,大部分物种的果荚内有数量惊人的种子,以种子库的方式保存兰科种质资源具有占用空间小、花费少、同时能保存大量种类和遗传多样性等优势,是兰科植物保护的理想途径[6-8]。

种子生活力检测是建设兰科植物种子库等迁地保护工作必不可少的环节[8]。目前,兰科植物种子生活力检测方法主要有四氮唑法(TTC)、荧光素双醋酸酯染色法(FDA)、紫外分光光度计法(UVS)、埃文斯蓝染色法(Evans blue,EB)、萌发测定法等[8-10]。其中,TTC法是最常用的种子生活力测试方法之一,因检测快速常用于一些萌发耗时长的物种种子生活力测定[8]。然而,某些兰科物种具有深色或坚硬种皮,甚至同一物种的不同居群存在生态型的分化等原因均可能导致TTC法检测的结果出现差异,例如不同地理来源的美须兰(原变种)(Calopogontuberosusvar.tuberosus)种子,北方居群的种皮较南方种群厚,渗透性更差,TTC法对南方居群提供了相对准确的生活力评估[11-12]。和TTC法一样,FDA法也属于酶促种子生活力检测方法,但由于一些酶活性在细胞死亡后也有可能持续存在,从而导致检测结果的假阳性[8,13-14]。UVS是在电导率测定法的基础上改进的方法,实验操作简单快捷,但需要与萌发率联合分析,而不能直观地给出检测结果[15]。EB法是基于细胞膜的完整性,阻止细胞外的EB染色剂进入细胞来判断种子生活力,属于非酶促种子生活力检测法[8,16],相较于TTC法和FDA法,EB法不依赖酶活性,结果更加稳定和可靠,却需要丰富的操作经验[8,17]。萌发测定法常常需要与其他测定方法联用[9],往往耗时较长。地生兰种子非共生萌发时间比附生兰更长[12],检测结果又极易受到非共生萌发操作时灭菌试剂种类和灭菌时间的影响。兰科种子灭菌过程中灭菌试剂在清除种子表面污染的同时也会渗透种皮并对种胚造成伤害,从而降低种子生活力[8]。不同物种种皮渗透性不同,附生兰种子往往比地生兰种子更具渗透性[18],表现出种子灭菌耐受性的差异。筛选一种便捷、高效的兰花植物种子生活力检测和灭菌方法对其保存、生活力评估和物种保护都具有重要意义。

金耳石斛(Dendrobiumhookerianum)和长瓣万代兰(Vandalongitepala)是主要分布于高黎贡山生物多样性热点地区的2种附生兰。其中,金耳石斛被列为国家Ⅱ级保护野生植物(2021版)[5],濒危等级为易危(Vulnerable,VU)[19];长瓣万代兰为本文作者近年发现于云南省怒江傈僳族自治州高黎贡山地区的新纪录种。石斛属和万代兰属植物由于在花型、花色、唇瓣上的多样性,具备重要园艺观赏价值[20-21]。金耳石斛还具有较高的药用价值,由于受到长期掠夺式采挖,野生资源遭受严重破坏[22]。本研究通过采用TTC法和非共生萌发测定法相结合测定各自的种子生活力,比较2种方法的测定结果,以期筛选出一种便捷、高效的测定附生兰种子生活力的通用方法,为兰科植物的收集保存及可持续利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为金耳石斛和长瓣万代兰,见图1。

图1 金耳石斛和长瓣万代兰的开花植株

金耳石斛(图1a)为国家重要野生植物种质资源库联盟成员于2020年在高黎贡山收集的同一居群刚要开裂的蒴果,长瓣万代兰(图1b)为云南省林业和草原科学院蒋宏研究员于2019年从高黎贡山收集引种的同一居群植株,种植于云南省林业和草原科学院温室,人工异花授粉获得的蒴果。在实验室内分别取出2个种的多个蒴果中的种子,按种混匀后均匀平铺到培养皿中的滤纸垫层上,置于盛有饱和氯化锂(LiCl)溶液的干燥器中,在20℃条件下干燥4 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 种子表面灭菌

前期进行预实验筛选不同灭菌试剂的灭菌时间并设定梯度(金耳石斛:75%酒精灭菌处理2、4、6、8、10 min,0.1% HgCl2灭菌处理4、8、12、16、20 min,2% NaClO灭菌处理4、8、12、16、20 min,1% NaDCC灭菌处理10、20、30、40、60 min。长瓣万代兰:75%酒精灭菌处理2、4、6、8、10 min,0.1%HgCl2灭菌处理30、60、90、120、150 s,2% NaClO灭菌处理30、60、90、120、150 s,1% NaDCC灭菌处理10、20、30、40、60 min)。种子灭菌处理期间,纯化柱上下颠倒及轻微摇晃,使种子与灭菌溶液充分接触,结束后,600～800 rpm离心1 min,去灭菌液,然后无菌水漂洗4～5次,再用1 mL移液枪取600 μL无菌水加入吸附柱中,反复吸打使之呈种子悬浮液,吸取400 μL种子悬浮液播种到培养皿中培养基上,接种15个培养皿,试验重复3次。

1.2.2 种子生活力测定

1.2.2.1 非共生萌发测定种子生活力

用小药匙分别取干燥后的金耳石斛和长瓣万代兰适量种子装入无菌DNA纯化柱(经121℃,灭菌20 min,规格:吸附柱1 mL,收集管2 mL)中,标记代号,加入600 μL无菌水,浸泡24 h。在超净工作台中,600～800 rpm离心1 min,去无菌水,分别加入700 μL 75% 酒精[23]、0.1% HgCl2(升汞)[24]、2% NaClO[12](次氯酸钠,有效氯10%,天津市风船化学试剂科技有限公司)和1% NaDCC[6](优氯净,上海麦克林生化科技股份有限公司),另设一组全程仅用无菌水处理的干燥后种子作为对照

1.2.2.2 TTC染色法测定种子生活力

将接种后纯化柱中剩余的种子600～800 rpm离心1 min,去无菌水,加入800 μL 1% TTC溶液,在温度30℃,黑暗条件下处理24 h[25],无菌水漂洗5次,加入600 μL无菌水制成种子悬浮液,取200 μL于载玻片上置于蔡司体视显微镜(SteREO Discovery.V8)下,随机挑选3个视野,观察种子染色情况,有生活力种胚被染成不同程度的红色,无生活力种子种胚不着色,分别计数每个视野的种子总数和有生活力种子总数,并计算种子生活力[8]。

1.2.3 种子萌发培养

金耳石斛种子萌发培养基采用MS+0.5 mg/L NAA +20 g/L蔗糖+10% 椰子汁+8 g/琼脂[10](1182KG001,600-1 300 g/cm2,BioFroxx,下同),长瓣万代兰种子萌发培养基为1/2 MS+ 20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂+1 g/L活性炭[26],pH值5.8～6.0。置于光照强度1 600～2 000 Lx,光照时间12 h/d,温度23±2℃条件下培养。

1.3 数理统计

将培养7～10 d后的培养皿置于蔡司体视显微镜下随机选取3个视眼,种子种胚吸胀膨大记为萌发[27-28],计算种子萌发率。污染材料也计入萌发数据统计。

数据处理所需公式:

污染率(%)=污染培养皿数/接种培养皿总数×100%

染色率(%)=着色种子数/统计种子总数×100%

萌发率(%)=萌发种子数/统计种子总数×100%

采用Excel 2021软件进行数据整理,SPSS 27.0.1软件对接种污染率、种子TTC染色率和萌发率作单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 非共生萌发测定种子生活力

2.1.1 75%酒精对种子萌发率的影响

以无菌水处理的对照组金耳石斛和长瓣万代兰污染率分别为42.22%和40%,萌发率为97.34%和89.34%。种子经75%酒精灭菌2、4、6、8、10 min后的萌发率见表1。灭菌2 min后,金耳石斛和长瓣万代兰种子都达到较好的灭菌效果,随着灭菌时间的增加,经方差分析金耳石斛种子萌发率与对照相比没有显著性差异。长瓣万代兰处理2 min后,种子萌发率为35.21%与对照相比极显著下降,处理10 min时,降到4%以下。灭菌试剂对长瓣万代兰种胚造成了伤害,影响种子萌发率。

2.1.2 0.1% HgCl2对种子萌发率的影响

金耳石斛种子在0.1% HgCl2条件下灭菌0、4、8、12、16、20 min后的萌发率见表1。种子灭菌处理16 min内与对照相比萌发率没有显著性差异,处理20 min后,种子萌发率有显著下降,但种子萌发率仍然在90%以上。萌发试验中金耳石斛用0.1% HgCl2灭菌时间应控制在16 min以内。长瓣万代兰在灭菌处理30～150 s后,种子最高萌发率只有1.66%,灭菌试剂可能对种胚造成了极大伤害,长瓣万代兰不适合用0.1% HgCl2作为灭菌试剂。

2.1.3 2% NaClO对种子萌发率的影响

用2% NaClO对金耳石斛和长瓣万代兰种子进行灭菌,萌发率结果见表1。金耳石斛处理20 min后,萌发率为96.49%,经方差分析与对照相比没有显著性差异,维持着较高的萌发率。长瓣万代兰处理30 s时,种子萌发率为80.26%,随着处理时间的延长,种子萌发率极显著下降,处理150 s后,降到3%以下。长瓣万代兰处理30 s后存在4.45%左右的污染率,处理60 s后才有较好的灭菌效果,但与对照相比萌发率已极显著下降。

2.1.4 1% NaDCC对种子萌发率的影响

由表1可知,金耳石斛和长瓣万代兰处理10 min后污染率为0,且随着灭菌时间的增加,金耳石斛各处理间种子萌发率也没有显著性差异,处理60 min后,种子萌发率为94.51%。长瓣万代兰灭菌处理40 min时种子萌发率没有显著性差异,处理60 min后,与对照相比有显著性下降,为80.30%。1% NaDCC对种子的萌发率影响较小,维持较高的萌发率。随着灭菌时间延长,1% NaDCC灭菌试剂对长瓣万代兰的种皮可能具有腐蚀作用,种皮颜色由原来的棕黄变为透明(图2)。1%NaDCC灭菌处理后两种附生兰种子都有较好的表面灭菌效果,且对种胚的伤害小,维持着较高的萌发率,也许可以作为种子在萌发法测定种子生活力时的通用灭菌试剂。

图2 金耳石斛和长瓣万代兰种子经过1% NaDCC灭菌后TTC染色和萌发情况

2.2 TTC染色法测定种子生活力

由表1可知,由无菌水处理的对照组金耳石斛和长瓣万代兰种子TTC染色率分别为96.49%和88.65%,萌发率为97.34%和89.34%,2种附生兰萌发率均高于染色率,误差较小为0.85%和0.69%。种子经过不同灭菌处理后再进行TTC染色,与相应的萌发率比较,其稳定性存在较大差异。75%酒精处理过程中,金耳石斛的染色率和萌发率误差较小,在0.33%～2.74%之间,长瓣万代兰误差在3.67%～29.48%,种子染色率整体偏高;0.1% HgCl2处理中,金耳石斛的染色率和萌发率误差小于1.6%,长瓣万代兰染色率为0,染色率和萌发率误差在1.66%以内;2% NaClO处理中,金耳石斛的染色率和萌发率误差小于1.44%,长瓣万代兰误差在2.85%～28.58%,种子染色率整体偏低;1% NaDCC处理中,金耳石斛的染色率和萌发率误差在0.92%～3.53%,长瓣万代兰误差从20.32%到60.18%,种子染色率整体偏低。金耳石斛种子灭菌处理后与对照相比TTC染色法测得的种子生活力均较稳定,相应的萌发率误差在3.53%之内,变化幅度小,结果可靠,可用于金耳石斛种子生活力评估。长瓣万代兰对照组染色率和萌发率之间误差小较稳定,灭菌处理后TTC染色法测得的种子生活力不稳定,存在较大误差,种子染色率整体偏低,表明灭菌试剂影响了长瓣万代兰种子TTC染色的稳定性。

3 讨论与结论

3.1 讨论

种子生活力的测定有多种方法,其中萌发试验是首要方法[12]。萌发率常常作为其他活力测定方法的参照标准[16,29]。兰科植物种子萌发率测定包括共生和非共生萌发2种途径,但在萌发前都需要对种子进行灭菌。由于物种不同、果荚开裂与否、以及种皮结构的差异导致种皮的渗透性不同,种子的灭菌处理方法各不相同[7,12,18]。

本试验通过对金耳石斛和长瓣万代兰种子进行不同灭菌方法处理后播种,统计和比较了不同灭菌试剂处理对种子萌发率的影响。结果表明,金耳石斛种子经过75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC计4种灭菌处理后整体都维持着较高的萌发率,仅在0.1% HgCl2处理20 min后种子萌发率显著下降,但仍然有94.68%,与同属的兜唇石斛(Dendrobiumaphyllum)[27]、齿瓣石斛(D.devonianum)[30]和华石斛(D.sinense)[10]结果相似,分别在1% NaClO、5% NaClO处理10、15、30 min后,都维持着较高的生活力。多种石斛属植物的种子在不同灭菌试剂及灭菌时间上整体显示出较好的耐受性,可能是灭菌耐受型种子。而与之相反,长瓣万代兰种子表现出不耐受性,75%酒精处理10 min后种子萌发率降到4%以下,0.1% HgCl2处理30 s后降到2%以下,在2% NaClO溶液处理150 s后降到3%以下,与附生兰多穗兰(Polystachyaconcreta)在0.3% NaClO灭菌5 min,种子萌发率降到了5%以下,0.5% NaClO灭菌3 min种子生活力丧失[31]的研究结果类似,对灭菌试剂比较敏感,可能是灭菌不耐受型种子。相较而言,金耳石斛的种子气腔要大于长瓣万代兰种子,由于种皮与种胚之间存在气腔可能阻碍液体流入,长瓣万代兰几乎没有气腔,种皮紧贴种胚,溶液快速与种胚接触[9,32],灭菌试剂可能对种胚造成伤害,从而影响种子的萌发率。

兰科种子属于粉尘类种子,大小(种子长度)在0.05～6 mm之间[33-34],不宜用传统的解剖染色分析法进行活力检测。利用TTC染色法检测兰科种子生活力,已成功的运用到了附生兰和一些地生兰科植物[6,35-36],具有简单、快捷、易上手等优点。在本试验中,种子经过不同灭菌试剂处理后再进行TTC染色,与相应的萌发率比较,其稳定性存在差异。金耳石斛染色率和萌发率之间稳定性较好,误差为0.16%～3.53%,变化幅度小;长瓣万代兰存在较大误差,在1% NaDCC处理后TTC染色率和萌发率之间最高达60.18%,说明灭菌处理对TTC试剂的染色效果影响较明显(图2),这与Pradhan等[8]研究结果一致。长瓣万代兰种子经过75%酒精处理后,染色率高于萌发率,原因可能是TTC法属于酶促检测法,依赖于脱氢酶的活力,然而一些酶可能在细胞死亡后也持续存在于种子中,产生假阳性的活力检测结果[13-14,17],而在次氯酸盐处理中,可能由于种皮结构、渗透性等差异导致灭菌试剂的残留干扰了TTC脱氢生成甲瓒[12],减少在种胚细胞内的积累,染色率偏低。金耳石斛的种子为“石斛属型”,种子呈稍长锯屑状,种皮细胞的垂周壁竖直,覆盖细胞间隙,整个种子表面密被疣状至鳞片状沉积物,可能有一定的疏水性。长瓣万代兰的种子为“万代兰属型”,种子呈锯屑状,种皮细胞的垂周壁竖直坚硬,细胞间隙凹陷,种子表面光滑,偶有疣状凸起[34]。两者种子形态相似,但种皮细胞间隙连接紧密程度以及是否具疣状凸起等沉积物细微结构也可能导致了灭菌耐受性的差异。尽管TTC染色法已经成功运用到一些附生兰生活力的测定[12],为进一步确保染色率的准确性,类似长瓣万代兰等“万代兰属型”灭菌不耐受性种子的TTC染色最好在灭菌处理前进行,而“石斛属型”种子在灭菌前后皆可。

3.2 结论

综上所述,金耳石斛和长瓣万代兰种子分别经过75%酒精、0.1% HgCl2、2% NaClO、1% NaDCC灭菌处理后进行种子生活力检测,2种附生兰种子由于在种子气腔、种皮细胞间隙连接紧密程度以及是否具疣状凸起等沉积物细微结构上的不同,可能导致了对灭菌试剂耐受性存在差异,金耳石斛耐受性较好,属于灭菌耐受型种子,长瓣万代兰属于灭菌不耐受型种子。1% NaDCC对两种附生兰种子萌发率的影响最小,处理10～40 min后萌发率没有显著性差异,是本试验中2种附生兰种子的最佳灭菌处理方法,可能可以作为未来大批量兰科植物种子灭菌较为通用的灭菌试剂,但还需要在更多的不同生活型物种中进行验证。