夏季不同播期对苜蓿抗寒性及越冬的影响研究

刘 罡，张庆昕，张玉霞，朱爱民，陈卫东，田永雷

（1.内蒙古民族大学草业学院，内蒙古 通辽 028043；2.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010010；3.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

苜蓿（Medicago sativaL.）在世界各国均有种植，种植面积因地而异［1］，因其具有良好的适应能力，寒冷地区和湿热地区均有栽培，其秋眠级越低则越耐寒，反之则抗寒性较弱。自20世纪50年代起至今，国内外学者对苜蓿抗寒性的研究较多［2-5］，目的是探究苜蓿抗寒生理及生化机制，筛选苜蓿抗寒基因，培育高产抗寒的苜蓿品种。苜蓿越冬期根颈会经历由多种胁迫共同引起的复杂过程，当胁迫达到一定程度，会使苜蓿发生冻害，严重会造成苜蓿死亡。相关研究表明，苜蓿根颈保护酶活性会直接影响苜蓿抗寒能力［6-9］，其中，苜蓿根颈中的部分抗氧化酶能减轻低温胁迫造成的活性氧分子对细胞的损害［10］。寇建村等［11］、朱爱民等［12］的研究显示，在低温锻炼期苜蓿根颈中抗氧化酶活性增强。王绛辉等［13］指出，高海拔寒冷地区苜蓿根系中的抗氧化酶活性较强。苜蓿根颈中抗氧化酶活性与苜蓿抗寒性密切相关，且苜蓿根颈中可溶性蛋白含量在不同水平低温处理下的表现也有所差异。KRASNUK等［14］对紫花苜蓿抗寒性的研究表明，在苜蓿根内可溶性蛋白含量升高过程中的一个关键影响因素是低温胁迫程度的增加。WLDNGM等［15］认为，在提高植物抗寒性的过程中，可溶性蛋白含量的增加发挥了较大作用。在一定低温条件下，苜蓿会为抵御低温胁迫而进行自我调控，但在不同低温胁迫下，苜蓿发生的生理、生化反应及苜蓿的抗冷阈值等，还有待进一步研究。

选择适合的播种时期对于苜蓿的健康生长及安全越冬具有重要意义［16］。被誉为“中国草都”的内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗，该地区春季风沙大、温度低，不利于苜蓿的春季播种；夏季高温，过早播种田间杂草多，过晚播种苜蓿生长较弱，不利于安全越冬。因此，通过对不同播种时期的苜蓿做低温处理，测定根颈抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量，以翌年苜蓿越冬率为指标，探讨不同播期对苜蓿的抗寒性以及越冬能力的影响，为当地苜蓿安全越冬提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验区概况

试验于内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁旗牧草生产基地（42°30′50′′N，115°27′34′′E）进行。该地区年均降水量约375 mm，无霜期140～150 d，年均风速3.0～4.4 m/s，年均气温5.5 ℃，≥10 ℃的积温为3 000～3 200 ℃；试验地土壤主要营养成分见表1。

表1 试验地土壤营养成分及pHTab.1 Soil nutrient and pH in the test site

1.2 试验材料

供试苜蓿品种为公农1号（Gongnong No.1，由吉林省农业科学院草地研究所提供）、骑士T（Knight T，购自北京佰青源畜牧业科技发展有限责任公司）、擎天柱（Optimus prime，购自北京正道生态科技有限公司）。

1.3 试验方法

试验于2017 年进行，设4 个播期，分别为7 月1 日、7 月15 日、8 月1 日、8 月15 日，播种方式为条播。每个小区面积为3 m×4 m，随机区组排列，4次重复，小区之间有0.5 m过道，共48个小区，不进行秋季刈割，土壤冻融期（2017年11月10日）直接对苜蓿根系取样。所采样品4 ℃低温保存，待低温处理。

低温处理试验：参考朱爱民等［5］采用的试验方法，分别依照5、-5、-10、-15、-20、-25 ℃目标温度对苜蓿进行低温胁迫处理。以4 ℃/h的速率对低温程控箱温度进行调节，达到目标温度后稳定保持6 h。完成低温处理后以4 ℃/h的速率对试验材料进行升温，达到室温后取出，并立即进行抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的测定。

1.4 测定项目及方法

可溶性蛋白含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性均采用邹琦［17］生理实验指导方法测定。越冬率以存活株数占植株总数的百分比表示。

1.5 数据分析

使用Microsoft Excel 2020进行数据处理和图表制作。采用SPSS 17.0软件进行方差分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 播期和低温处理对苜蓿根颈抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的影响

品种、品种+播期、品种+播期+温度处理对苜蓿根颈SOD活性、CAT活性、POD活性、可溶性蛋白含量影响均不显著；播期对苜蓿根颈SOD活性和可溶性蛋白含量影响极显著（P＜0.01）；SOD活性、CAT活性和POD活性对低温的响应较敏感（表2）。可见播期和温度处理与苜蓿的抗寒性密切相关。

表2 处理与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、可溶性蛋白之间的相关性分析Tab.2 Correlation analysis between treatment and superoxide dismutase，catalase，peroxidase，soluble protein

2.2 不同播期苜蓿越冬率比较

随播种时期的推迟，供试3个苜蓿品种越冬率均逐渐降低。8月播种的苜蓿越冬率较7月1日播种均显著降低（P＜0.05）。由于2017年至2018年冬季温度较低，该地区苜蓿大面积受到冻害影响，7月1日播种的苜蓿越冬率均不足60.0%。见图1。

图1 苜蓿越冬率在不同播期下的变化Fig.1 Changes of overwintering rate of alfalfa in different sowing time

2.3 低温胁迫对苜蓿根颈抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影响

2.3.1 低温胁迫对苜蓿根颈中SOD活性的影响

随处理温度的降低，苜蓿根颈SOD活性呈先升高后降低再升高的变化趋势，其中，苜蓿根颈SOD活性于-15 ℃胁迫下最低，为134.3 U/g；-5、-20 ℃胁迫下根颈SOD活性均显著大于-15 ℃处理（P＜0.05）；-25 ℃胁迫下根颈SOD活性最高，为209.9 U/g，且显著高于其他5个处理（P＜0.05）。见图2。

图2 不同低温胁迫下苜蓿根颈中SOD活性变化Fig.2 Changes of SOD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.2 低温胁迫对苜蓿根颈中CAT活性的影响

随处理温度的降低，苜蓿根颈CAT活性呈逐渐降低趋势，其中，5、-5 ℃条件下苜蓿根颈CAT活性较高，分别为46.7、42.4 U/（min·g），均显著高于其他4个处理（P＜0.05）；-25 ℃条件下苜蓿根颈CAT活性最低，为6.9 U/（min·g），显著低于其他处理（P＜0.05）。见图3。

图3 不同低温胁迫下苜蓿根颈中CAT活性变化Fig.3 Changes of CAT activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.3 低温胁迫对苜蓿根颈中POD活性的影响

随处理温度的降低，苜蓿根颈中POD 活性呈现先降低后升高再降低的变化趋势。5 ℃处理POD 活性为646.7 U/（min·g），显著高于其他5个处理（P＜0.05）；在-5、-15 ℃处理下两者间差异不显著，分别为506.2、513.8 U/（min·g），显著大于-20、-25 ℃处理（P＜0.05）；其他3个处理间苜蓿根颈POD活性差异不显著。见图4。

图4 不同低温胁迫下苜蓿根颈中POD活性变化Fig.4 Changes of POD activity in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.3.4 低温胁迫对苜蓿根颈中可溶性蛋白含量的影响

随处理温度的降低，苜蓿根颈可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的变化趋势，在-5、-20 ℃时，分别达到高峰，-20 ℃条件下显著大于其他处理（P＜0.05）；在-10、-25 ℃条件下各自达到一次低峰，分别为16.3、17.0 mg/g，较-5 ℃处理显著降低（P＜0.05）。见图5。

图5 不同低温胁迫下苜蓿根颈中可溶性蛋白含量变化Fig.5 Changes of soluble protein content in alfalfa root collar in different low-temperature stress

2.4 不同播期处理对苜蓿根颈抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影响

2.4.1 不同播期处理对苜蓿根颈SOD活性的影响

苜蓿根颈SOD 活性对不同播期处理响应不同，其中，7 月播种的苜蓿根颈SOD 活性均偏高，分别为177.7、168.1 U/g，均显著大于8 月播种的处理（P＜0.05）；8 月1 日和8 月15 日播期处理之间苜蓿根颈中SOD活性差异不显著。见图6。

图6 苜蓿根颈SOD活性在不同播期下的变化Fig.6 Changes of alfalfa root collar SOD activity in different sowing time

2.4.2 不同播期处理对苜蓿根颈CAT活性的影响

苜蓿根颈CAT活性在7月15日播种处理中达到31.3 U/（min·g），在4个播期中最高，显著高于8月1日播种处理（P＜0.05），与7月1日播种处理的29.86 U/（min·g）和8月15日播种处理的28.58 U/（min·g）差异不显著；苜蓿根颈CAT活性在另外3个播种时期处理间均无显著差异。见图7。

图7 苜蓿根颈CAT活性在不同播期下的变化Fig.7 Changes of alfalfa root collar CAT activity in different sowing time

2.4.3 不同播期处理对苜蓿根颈POD活性的影响

苜蓿根颈POD 活性在8 月15 日播期处理达到最高，为524.3 U/（min·g），显著高于8 月1 日处理（P＜0.05），但与7 月1 日和7 月15 日播期处理间差异不显著；7 月1 日、7 月15 日和8 月1 日播种的苜蓿根颈中POD 活性差异不显著。见图8。

图8 苜蓿根颈POD活性在不同播期下的变化Fig.8 Changes of alfalfa root collar POD activity in different sowing time

2.4.4 不同播期处理对苜蓿根颈可溶性蛋白含量的影响

苜蓿根颈可溶性蛋白含量7月1日和7月15日播种处理分别为30.74 mg/g和28.64 mg/g，显著高于8月份播种的2个处理（P＜0.05）；而7月1日与7月15日播种处理之间、8月1日与8月15日播种处理之间苜蓿根颈可溶性蛋白含量差异均不显著。见图9。

图9 苜蓿根颈可溶性蛋白含量在不同播期下的变化Fig.9 Changes of alfalfa root collar soluble protein content in different sowing time

2.5 苜蓿根颈生理生化指标与越冬率的相关性分析

苜蓿越冬率受其根颈中SOD活性影响的同时，也受到可溶性蛋白含量的影响，数据表明越冬率与二者均显著正相关（P＜0.05）；但苜蓿越冬率与苜蓿根颈中POD和CAT活性未表现出显著相关性（表3）。

表3 苜蓿越冬率与根颈抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量的相关性分析Tab.3 Correlation analysis of alfalfa overwintering rate with antioxidant enzyme activity and soluble protein content in root collar

3 讨论

3.1 苜蓿根颈抗氧化酶活性对播期和低温胁迫的响应

田永雷等［18］研究表明，播种时期对紫花苜蓿根颈中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性影响明显，播种较晚的苜蓿根颈中抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性较低，与本研究结果相同。本研究结果表明，播期对苜蓿根颈SOD活性影响显著，而对苜蓿根颈CAT和POD活性影响不明显。根系中的保护酶活性直接影响紫花苜蓿抗寒能力的大小，对于苜蓿抗寒力的提高有特殊意义［12］。但也有不同结论，马周文等［19］研究低温胁迫对紫花苜蓿生理指标的影响结果表明，不同低温处理下苜蓿体内SOD、CAT 活性的变化差异较小。而本研究结果显示，苜蓿根颈CAT活性随处理温度的降低而降低，说明苜蓿根颈CAT活性对低温响应明显。罗新义等［20］、邓雪柯等［21］研究表明，低温胁迫下苜蓿根颈中SOD活性的提高有利于降低苜蓿自由基对细胞膜的损害以提高苜蓿的抗寒性，与本研究结果一致。前人研究结果表明［22-24］，POD活性对植物抗寒性具有积极作用。与冯昌军等［24］研究结果部分相同，本研究相关性分析结果表明，苜蓿根颈POD活性与越冬率相关性不显著，但POD 活性随处理温度的降低呈降低-升高-降低的变化趋势，说明苜蓿根颈POD活性对低温的响应是明显的，当苜蓿受低温胁迫强度较小时，苜蓿可以通过增强根颈POD活性来抵御，当胁迫温度超过苜蓿耐寒极限时，苜蓿根颈POD活性迅速下降，并逐渐失去活性，造成苜蓿死亡。因此，抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性对苜蓿的抗寒性具有正效作用，然而这种抗氧化酶保护机制是有限的，当低温胁迫超过一定范围时，苜蓿依然会受冻害而死亡。

3.2 苜蓿根颈可溶性蛋白含量对播期和低温胁迫的响应

有研究表明，低温胁迫下苜蓿根和根颈中可溶性蛋白含量增加［25-28］。杜永吉等［29］、KRASNUK等［14］研究表明，苜蓿根内可溶性蛋白含量会因低温胁迫程度的增加而提高且达到差异显著水平。崔国文［10］研究结果则与以上学者研究结果不同，在该研究中，苜蓿的抗寒能力强弱并不能与根颈中可溶性蛋白含量产生统计学联系。本研究结果显示，在-5～-25 ℃低温处理间苜蓿根颈中可溶性蛋白含量呈升高-降低-升高-降低的变化趋势，表明苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量与苜蓿抗寒性相关，且在不同低温处理下表现不同；本研究相关性分析结果亦支持此观点，低温胁迫下根颈中可溶性蛋白含量变化很大程度上影响着苜蓿越冬率，而苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量又与播期的推迟显著负相关，即播种越晚则苜蓿根颈中的可溶性蛋白含量越低；而可溶性蛋白含量与苜蓿越冬率的相关性极显著。因此，笔者认为播种晚会造成苜蓿抵御低温的能力减弱，同时，在苜蓿抵御低温过程中，其根颈可溶性蛋白含量也具有重要作用。

4 结论

苜蓿根颈中抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量规律性变化对苜蓿的抗寒性具有正效作用。夏季早播（7月1日至7月15日）有利于苜蓿安全越冬，苜蓿可以通过提高根颈抗氧化酶活性来抵御低温胁迫。