弗氏柠檬酸杆菌的鉴定及其药敏试验

许国洋,付文贵,付利芝,闫志强,高广亮,邓 娟,戴玉娇,庞丽霞,翟少钦*

(1.重庆市畜牧科学院,重庆 402460;2.重庆市兽用生物制品工程技术研究中心,重庆 402460;3.重庆市潼南区农业农村委,重庆 402660)

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)是肠杆菌科柠檬酸杆菌属的一种革兰氏阴性人畜共患条件性致病菌[1-2]。该菌诱发人、哺乳动物和鱼类相关疫病的报道不断增多[3-14]。2022年9月重庆某规模化猪场40～50日龄断奶仔猪陆续出现细菌性腹泻症状,粪便呈黄绿色或黄白色,部分仔猪出现精神不振、消瘦等症状,对肛拭子样本进行病原菌分离鉴定,将纯化菌株的16S rRNA基因序列在NCBI中Blast比对分析后,初步确定主要为大肠埃希氏菌和弗氏柠檬酸杆菌。研究表明,引起仔猪腹泻的病原菌主要包括大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、猪痢疾短螺旋体和沙门氏菌等[15],关于猪源弗氏柠檬酸杆菌的病原特性研究及其是否会导致仔猪腹泻罕见报道。本研究拟对从该猪场分离到的弗氏柠檬酸杆菌开展进一步鉴定分析,明确其病原特性和对小鼠的致病性,为该菌致病机理研究和仔猪潜在细菌性疫病防治提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康昆明小白鼠,6～8周龄,体重28 g±2 g,购自重庆米科斯生物科技有限责任公司。

1.1.2 主要试剂 2×TaqPCR Master Mix、DL 2 000 DNA marker,宝生物工程(大连)有限公司产品;大豆酪蛋白琼脂(TSA)培养基,上海莼试生物技术有限公司产品;小牛血清(国产),上海启达生物科技有限公司产品;TIANamp Bacteria DNA Kit、Tiangel Mini Purification Kit,天根生化科技(北京)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 凝胶成像系统(CL750),Thermo公司产品;全自动型生化培养箱(SPX-150B),山东霍尔德电子科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 分离株的培养 将分离自腹泻仔猪肛拭子且初步确定为弗氏柠檬酸杆菌的分离株进行革兰氏染色镜检,并划线接种于含5%兔鲜血TSA培养基,37℃培养48 h,观察是否有溶血现象。将分离株接种于含10%小牛血清的TSA培养基,利用烛缸法[16]将培养基置于容量为2 000 mL的磨口玻璃干燥器中,点燃蜡烛,玻璃盖边沿涂凡士林后,密封,待火焰自行熄灭后置于37℃全自动型生化培养箱中培养 48 h后观察菌落生长情况。

1.2.2 生化鉴定 挑取该分离株单菌落扩大培养后,参照细菌微量生化指标检测说明书进行生化鉴定,生化鉴定项目包括糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露醇)、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水(MR、VP试验)、尿素酶试验、枸橼酸盐试验、山梨醇试验、蛋白胨水试验。

1.2.3 药敏试验 采用常规纸片琼脂扩散(K-B)法,检测菌株对头孢噻肟等20种常用抗菌药物的敏感性,依据抑菌圈直径大小判定各菌株对药物的敏感性,抑菌圈直径<10 mm表示其对抗生素耐药(N),10 mm≤～<15 mm的为中度敏感(M),≥15 mm的为高度敏感(S)。

1.2.4 耐药基因检测 参照明杨等[17]的方法,设计耐药基因特异性引物,由上海生物工程有限公司合成,引物序列信息见表1。提取该分离株基因组为模板,利用表1中设计的β-内酰胺酶类blaZ、mecA基因,大环内酯类ermA、ermB、ermC基因,氨基糖苷类aacA-aphD基因,四环素类tetK、tetM基因,糖肽类vanA基因,喹诺酮类ileS、fusB基因,磺胺类rpoB基因对应的12种鉴定引物,进行PCR扩增,对含有预期大小条带的PCR产物纯化后送生工生物工程技术有限公司测序,测序结果在GenBank中进行Blast比对,分析该菌耐药基因携带情况。

表1 引物序列信息

1.2.5 分离菌株对小鼠致病性分析 挑取菌株单菌落进行扩大培养,用PBS稀释成108CFU/mL,将菌悬液通过腹腔注射接种10只小鼠,0.2 mL/只,并设对照组,腹腔注射PBS 0.2 mL/只,正常饲喂7 d,每12 h观察记录一次小鼠发病情况,计算小鼠死亡率。对死亡小鼠进行解剖,观察各组织器官病变情况,并无菌采集心血,划线接种TSA培养基中,观察菌落生长情况,参照1.3对生长的菌落进行鉴定。

1.2.6 病理组织学分析 试验结束后,通过颈椎脱臼处死各组小鼠,采集小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肠道组织,放置于多聚甲醛固定液中固定,送重庆米科斯生物科技有限责任公司进行病理鉴定分析。

2 结果

2.1 分离株的培养

从采集的25份肛拭子样本中,均分离到致病性大肠埃希氏菌,其中4份同时检出疑似弗氏柠檬酸杆菌,基于该分离株16SrRNA基因序列分析,发现其与弗氏柠檬酸杆菌(NCBI登录号:MT133352.1)同源性较高(99%),在系统进化树中也与其聚为一簇。经革兰氏染色镜检后,发现其为革兰氏阴性小杆菌(图1),在5%兔鲜血琼脂平板中培养12 h后出现明显的溶血现象(图2),经烛缸法鉴定,该菌在培养至48 h时形成菌落,正常培养时,12 h即出现菌落,确定其为兼性厌氧菌。

图1 革兰氏染色镜检结果(10×100)

图2 溶血现象观察

2.2 生化鉴定结果

通过生化鉴定分析,发现仅尿素、蛋白胨水、木糖和枸橼酸盐试验为阴性,硝酸盐(还原)、MR、VP、山梨醇、葡萄糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖发酵均为阳性。

2.3 病原菌的耐药分析

药敏试验结果显示,分离的弗氏柠檬酸杆菌对头孢噻肟、丁胺卡那和头孢唑啉等10 种药物高度敏感,对氧氟沙星、诺氧沙星和万古霉素等5 种药物耐药,结果见表2。

表2 药敏试验结果

2.4 耐药基因检测

对弗氏柠檬酸杆菌耐药基因的分子鉴定发现,在639 bp、458 bp和732 bp出现单一条带,经测序确定该菌携带aacA-aphD(氨基糖苷类)、ileS(喹诺酮类)和vanA(糖肽类)3 种类型耐药基因(图3)。

M.DNA标准DL 2 000;1～12.依次为fusB基因、rpoB基因、ermB基因、blaZ基因、mecA基因、ermA基因、aacA-aphD基因、ermC基因、tetK基因、ileS基因、tetM基因、vanA基因

2.5 致病性分析

试验组小白鼠在接菌12 h后出现精神萎靡、嗜睡等症状,24 h后6 只小白鼠死亡,致死率为60%,对照组小白鼠健康状态良好。死亡小鼠剖检发现,肝脏和肺脏病变最明显,肝脏边缘轻微出血,质地变脆,肺脏严重淤血。对照组小鼠肝脏和肺脏均无病理变化。将试验组小鼠心血接种TSA平板12 h后出现单菌落,经分子鉴定,确定为弗氏柠檬酸杆菌。

2.6 病理组织学观察

病理组织观察显示,与对照组相比(图4F～J),试验组小鼠的肝脏、肺脏、肠道、肾脏和脾脏组织均出现不同程度的病理变化。其中,肝脏组织可见大量肝细胞脂肪变性,胞质内出现微型空泡,多量中央静脉淤血,小面积肝窦内可见淤血(图4A);肺脏组织可见小面积肺泡壁增厚,伴少量炎性细胞浸润,大量血管淤血,大面积肺泡壁间质淤血(图4B);肠组织偶见肠绒毛黏膜上皮与固有层轻度分离(图4C);肾脏组织可见少量肾小管上皮细胞空泡变性,胞质内出现微型空泡,多灶性髓质间质淤血,少量血管淤血(图4D);脾脏组织中大量白髓可见多量淋巴细胞坏死,核固缩,红髓少量中性粒细胞增多(图4E)。

A.肝脏,胞质内出现微型空泡(黑色箭头),中央静脉淤血(蓝色箭头),肝窦内可见淤血(绿色箭头);B.肺脏,肺泡壁增厚,伴炎性细胞浸润(黑色箭头);血管淤血(蓝色箭头),肺泡壁间质淤血(绿色箭头);C.肠道,肠绒毛黏膜上皮与固有层分离(黑色箭头);D.肾脏,肾小管上皮细胞胞质内出现微型空泡(黑色箭头),多灶性髓质间质淤血(蓝色箭头),少量血管淤血(绿色箭头);E.脾脏,淋巴细胞坏死,核固缩(黑色箭头),中性粒细胞增多(蓝色箭头);F～J.对照组。

3 讨论

仔猪腹泻是一种以胃肠道症状为主要特征的综合性疾病,常由多种致病因素引起,包括病毒、细菌和应激等,其中,仔猪细菌性腹泻影响仔猪的成活率、延缓生长发育、严重者导致发育停滞而成为僵猪,甚至发生死亡,给养猪业带来巨大经济损失[18]。目前,仔猪细菌性腹泻多由大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、猪痢疾短螺旋体和沙门氏菌等诱发[19]。弗氏柠檬酸杆菌在自然环境中分布广泛,当机体免疫力低下时,该菌可引起人体一系列的感染,包括泌尿道、胆道、肠道、呼吸道、心内膜、伤口、软组织以及脑膜感染等,且其危害有逐渐加重的趋势[7]。哺乳动物会因误食受其污染的食物而发病,出现腹泻症状,一般情况下,弗氏柠檬酸杆菌不会导致哺乳动物大量死亡[20]。刘会胜[9]从小尾寒羊细菌性感染死亡病例中分离到了弗氏柠檬酸杆菌,并分析了其对小尾寒羊的致病性,为国内外首次报道。黄晓东[21]等发现,弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病,且对中华绒螯蟹具有较强毒力。

本研究对仔猪腹泻病例肛拭子样本中分离纯化到的弗氏柠檬酸杆菌进行鉴定分析,药敏试验和耐药基因检测发现该菌对氨基糖苷类的链霉素,β-内酰胺类的青霉素,喹诺酮类的诺氧沙星和氧氟沙星,糖肽类的万古霉素耐药,且携带aacA-aphD(氨基糖苷类)、ileS(喹诺酮类)和vanA(糖肽类)3 种类型耐药基因,进一步证明该菌的耐药性与耐药基因正相关。通过腹腔注射方式将分离到的弗氏柠檬酸杆菌接种小白鼠,发现接种后12 h即可见轻微临床症状,其对小鼠的致死率达60%,小鼠肠道虽未见明显出血症状,但肠绒毛黏膜上皮与固有层偶见轻度分离,同时,小鼠的肝脏、肺脏、脾脏和肾脏组织均出现不同程度的病理损伤,其中,肝脏和肺脏组织的出血症状最为明显,组织病理学观察发现,肝脏组织可见多量中央静脉淤血,小面积肝窦内可见淤血;肺脏组织可见大量血管淤血,大面积肺泡壁间质淤血。通过分析弗氏柠檬酸杆菌对小鼠的致病性,进一步证实其不仅局限于肠道感染,也可引起小鼠全身多组织器官的感染。虽然,该菌是从腹泻仔猪肛拭子样本中获得,但样本中也同时检出了致病性大肠埃希氏菌,因此,弗氏柠檬酸杆菌是否可引起仔猪腹泻,造成组织损伤,仍需进一步验证分析。本文为弗氏柠檬酸杆菌致病机理的进一步研究提供了参考,也为仔猪潜在细菌性疫病防治提供了数据支撑。