绵羊支原体HSP70的原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

李祥龙,章志涛,孔令丽,罗雨昕,秦泽亮,王冬英,3*

(1.广西大学 动物科学技术学院,广西南宁 530004;2.广西水产畜牧业协会,广西南宁 530022;3.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心,广西南宁 530004)

嗜血支原体(HemotropicMycoplasma)是一类寄生于宿主红细胞表面、血浆及骨髓、具有多种形态、无细胞壁的支原体,最早命名为附红细胞体,分类为原生动物,后来将其分类为嗜血支原体属[1]。嗜血支原体可引起贫血、高热、黄疸、消瘦和流产等临床症状,主要感染羊、牛、猪和鹿等动物及人[2]。羊嗜血支原体病呈世界性分布,主要经吸血节肢动物传播[3],在我国,多数省份均有过绵羊支原体的报道,其中内蒙古自治区[4]、云南省[1]和辽宁省[5]的羊感染率较高。绵羊支原体不仅对养殖业危害巨大,且已被证实可感染人[6],该病的检出具有十分重要的意义。

ELISA方法因具有成本低廉、操作简便等特点,常用于规模养殖场的群体检测。HSP70蛋白是热休克蛋白家族中最保守的一类,具有抗原提呈作用,在多种支原体中可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生,这为其成为诊断抗原提供了理论依据[7]。

本研究旨在表达绵羊支原体的HSP70蛋白,建立一种特异性强、灵敏性高的绵羊支原体ELISA检测方法,为绵羊支原体的监测、诊断及试剂盒的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 pET-28a(+)载体,Takara公司产品;DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。

1.1.2 血清样品 30头山羊全血及血清采自广西壮族自治区河池市都安县;绵羊支原体阳性血清及阴性血清[8],嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasmaphagocytophilum)阳性血清[9],吕氏泰勒虫(Theilerialuwenshuni)阳性血清[9],均由PCR法检测得出;水牛大片吸虫阳性血清、绵羊支原体基因组DNA模板,由广西大学寄生虫实验室保存。

1.1.3 主要试剂 DreamTaqGreen PCR预混液(2×),基因组DNA纯化试剂盒,Thermo Fisher Scientific公司产品;质粒提取试剂盒,DNA胶回收试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;同源重组试剂盒,北京全式金生物技术有限公司产品;辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG,BCA 蛋白浓度定量试剂盒,TMB单组分显色液,明胶,北京索莱宝科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 水平电泳(DYY-6C),水平摇床(WB-9405B),北京六一生物科技有限公司产品;PCR(ProFlexTMPCR),核酸蛋白质分析仪(NanoDrop 2000c),紫外分光光度计(ND2000C),Thermo Fisher Scientific公司产品;凝胶成像仪(Kodak Gel Logic 1500),美国Kodak有限公司产品;酶标仪(iMark),垂直电泳仪(PowerPacTM),美国Bio-Rad有限公司产品;电子分析天平(BS223S),德国赛多利斯有限公司产品;恒温摇床(SKY211D),上海苏坤实业有限公司产品;超声破碎仪(Scientz-IID),宁波新芝生物科技有限公司产品;超净工作台(SW-CJ-2F),苏州安泰空气技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 HSP70蛋白抗原决定簇的综合预测 以DNAStar软件中的Antigenicity-jameson-Wolf方法对绵羊支原体HSP70蛋白潜在的抗原决定簇进行综合性预测,选择整体评分较高的部分进行原核表达,并通过Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白分子质量。

1.2.2 引物设计 根据1.2.1中抗原决定簇的预测结果,通过SnapGene软件设计同源臂引物。引物序列为:(F)5′-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGCAAAGGTTGAAGGAAGCTT-3′;(R)5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTAAGACTT-TGGGGGTTCTTGTTC-3′;设计pET-28a(+)载体反向扩增引物,引物序列为:(F)5′-GGATCCGCGACCCATTTGCTG-3′;(R)5′-CTCGAGCACCACCACCACCAC-3′。

1.2.3 目的基因以及载体的扩增 以pET-28a(+)载体、绵羊支原体基因组为模板,PCR反应体系(25 μL):DreamTaqGreen PCR预混液12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸5 min,循环32次;72 ℃再延伸8 min。PCR扩增后,产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 重组表达载体的构建 胶回收获得目的基因及pET-28a(+)载体的PCR产物,参照全式金同源重组试剂盒说明书构建重组质粒,转至DH5α感受态细胞后振荡培养,提取质粒,琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(昆明)股份有限公司测序。重组质粒命名为pET28a-HSP70。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达及纯化 将成功构建的重组质粒pET28a-HSP70转入BL21(DE3)感受态细胞振荡培养,37℃、200 r/min振荡培养12 h后,加入终浓度为 0.1 mmol/L的IPTG,37 ℃、200 r/min诱导表达8 h后4 ℃离心,在冰上进行超声破碎,离心后收集上清和沉淀进行SDS-PAGE鉴定。鉴定成功后,采用镍柱纯化重组蛋白。

1.2.6 最佳反应条件的优化 PBS将纯化后的重组蛋白分别稀释至4、2、1、0.5、0.25 μg/mL,每孔100 μL加入酶标板,4 ℃包被过夜;每孔加入150 μL浓度为1%的明胶,37 ℃封闭2 h;山羊感染绵羊支原体阴、阳性血清稀释度分别为1∶100、1∶200、1∶400,每孔加入100 μL,设3个重复孔,空白对照每孔加入100 μL PBS,设2个重复孔,封口后于37 ℃孵育1 h;兔抗山羊IgG-HRP用PBST分别以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000的比例稀释,每孔加入100 μL,封口后于37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μL TMB显色液,封口后于37 ℃孵育10 min;每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4终止显色,酶标仪测定OD450,计算P/N值。

1.2.7 最佳显色时间的确定 按前期优化好的反应条件,分别于37 ℃孵育5、10、15、20、25 min,酶标仪测定OD450,计算P/N值。

1.2.9 特异性试验 按照已优化的最佳反应条件,对嗜吞噬细胞无浆体阳性血清、吕氏泰勒虫阳性血清、大片吸虫阳性血清进行检测,同时设置绵羊支原体阳性对照,评估该方法的特异性。

1.2.10 灵敏性试验 按照已优化的最佳反应条件,分别以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400的比例稀释绵羊支原体阳性血清后进行试验,评估该方法的灵敏性。

1.2.11 重复性试验 采用同一批纯化的重组蛋白作为包被抗原,分别检测5份绵羊支原体阳性血清及5份绵羊支原体阴性血清,每份血清样品重复3次,测定OD450,根据变异系数来评价批内重复性,采用2份不同批次纯化的重组蛋白作为包被抗原,分别检测5份绵羊支原体阳性血清及5份绵羊支原体阴性血清,每份血清样品重复3次,测定OD450,根据变异系数来评价批间重复性。

2 结果

2.1 HSP70蛋白抗原决定簇的综合预测

以DNAStar软件中的Antigenicity-jameson-Wolf方法对绵羊支原体HSP70蛋白的抗原决定簇进行综合预测。结果表明,绵羊支原体HSP70蛋白C端的整体评分更高(图1),作为诊断抗原的潜力更大。选择绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列构建重组原核表达质粒,基因大小为1 152 bp,Protparam预测其蛋白分子质量约为42 ku。

图1 抗原决定簇预测结果

2.2 目的基因及载体的扩增

PCR扩增后凝胶电泳分析结果,扩增条带单一明亮,目的基因扩增产物大小为1 152 bp,pET-28a(+)载体扩增产物大小为5 335 bp,与已知大小相符(图2)。

M.DNA标准DL 10 000; 1.pET28a; 2.热休克蛋白70

2.3 重组质粒的构建及鉴定

提取阳性质粒后凝胶电泳分析结果,条带单一明亮,重组质粒pET28a-HSP70与pET-28a(+)空载大小分别为6 894、5 369 bp,与已知大小相符(图3)。测序结果经比对后显示:本研究所得到的绵羊支原体HSP70蛋白的基因序列与已报道的序列一致。

M.DNA标准DL 10 000; 1.pET28a空载; 2.重组质粒pET28a-HSP70

2.4 重组蛋白表达形式的鉴定

重组蛋白经诱导表达后,上清与沉淀在42 ku处均有明显条带,与预期蛋白分子量相同,表明重组蛋白既以包涵体形式存在,同时也以可溶形式存在(图4)。纯化包涵体会导致重组蛋白变性,而复性无法保证蛋白的空间结构完全还原,为减少对后续实验的影响,选择纯化上清以获得重组蛋白。

M.预染蛋白Marker; 1.诱导表达的pET28a空载体上清; 2.诱导表达的pET28a空载体沉淀; 3.诱导表达的重组蛋白上清; 4.诱导表达的重组蛋白沉淀

2.5 重组蛋白的纯化

重组蛋白在100 mmol/L与200 mmol/L咪唑洗脱产物的42 ku处有明显且单一的条带,表明重组蛋白纯化成功(图5)。

M.预染蛋白Marker; 1.流穿液; 2.20 mmol/L咪唑洗脱产物; 3.60 mmol/L咪唑洗脱产物; 4.100 mmol/L咪唑洗脱产物; 5.200 mmol/L咪唑洗脱产物; 6.500 mmol/L咪唑洗脱产物

2.6 最佳反应条件的优化

由表1可知,重组蛋白抗原包被浓度为4 μg/mL,血清稀释度为1∶100,酶标二抗稀释度为1∶2 000时,P/N值最大,为2.85。

表1 ELISA反应条件优化

2.7 最佳显色时间的确定

按前期优化好的反应条件,分别于37 ℃孵育5、10、15、20、25 min。结果表明,在显色时间为20 min时,P/N 值最大,为3.36。

2.8 临界值的确定

2.9 灵敏性试验

在最佳ELISA反应条件下进行试验。结果表明,在绵羊支原体阳性血清稀释度为1∶3 200时,OD450为0.533,大于临界值0.419,灵敏性可达到1∶3 200,灵敏性良好。

2.10 特异性试验

在最佳ELISA反应条件下进行试验。结果表明,建立的ELISA 检测方法对嗜吞噬细胞无浆体阳性血清(OD450=0.247)、吕氏泰勒虫阳性血清(OD450=0.335)、肝片吸虫阳性血清(OD450=0.230)检测均为阴性,特异性良好。

2.11 重复性试验

在最佳ELISA反应条件下进行试验。结果表明,批内变异系数为0.11%～6.45%,小于10%,批间变异系数为2.20%～10.24%,小于15%,重复性良好。

3 讨论

嗜血支原体病在世界各地广泛流行,严重影响养殖业的健康发展[2]。绵羊支原体是可感染羊的一种嗜血支原体,不仅对养殖业危害巨大,且已被证实可感染人,具有潜在的公共卫生学意义[6]。目前尚无针对该病的有效治疗药物和疫苗,因此该病的检出对其防控具有极为重要的意义。

HSP70蛋白具有抗原提呈作用,在多种支原体中可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生,这为其成为诊断抗原提供了理论依据[7]。本研究对绵羊支原体HSP70蛋白的C端进行了原核表达,并将纯化成功的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA检测方。结果表明,绵羊支原体阳性血清稀释度为1∶3 200时,检测结果仍为阳性,表明该方法灵敏性良好。对嗜吞噬细胞无浆体阳性血清、吕氏泰勒虫阳性血清、肝片吸虫阳性血清进行检测,结果均为阴性,表明该方法有特异性良好。在最佳ELISA反应条件下进行批内和批间的重复性实验,结果表明,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,表明该方法重复性良好。

嗜血支原体最早被命名为附红细胞体,分类为原生动物,21世纪将其分类为嗜血支原体属[1]。2004年,杨鹏华等[10]成功建立羊附红细胞体ELISA 诊断法,该方法阳性血清的最大稀释倍数为1∶1 280,本研究建立的ELISA方法阳性血清最大稀释倍数为1∶3 200,灵敏性更高。2011年,李继连等[11]成功建立羊附红细胞体的双抗体夹心ELISA诊断方法,该方法虽然比杨鹏华等[10]建立的ELISA诊断方法灵敏性更高,但需在检测前利用体外驱虫法制备抗原,操作繁琐,用时较长,当待检血样中的病原体数量较少时,无法确保结果的准确性。本研究建立的ELISA抗体检测方法,因具有成本低、耗时短、操作简便、对实验设备要求较低等特点,更适用于规模养殖场的群体检测。对于个体的诊断,因隐性感染的病羊体内抗体水平存在波动性,所以本研究建立的ELISA检测方法对体况下降或已表现出临床症状的个体的检测结果更为准确。

综上所述,本研究成功对绵羊支原体HSP70蛋白的C端进行了原核表达,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体的间接ELISA抗体检测方法,该方法特异性、灵敏性、重复性良好,操作简便,为绵羊支原体的监测、诊断及试剂盒的开发提供了技术支持。