超高效液相色谱法检测大豆异黄酮含量

◎ 靳 颖

（黄河交通学院，河南 焦作 454950）

大豆异黄酮（CatheRine Genistein）是黄酮类化合物的一种，它作为一种次生代谢产物，形成于大豆植物体生长过程。大豆异黄酮结构与雌激素相似，因此又称植物雌激素[1]。大豆异黄酮不仅具有明显的抗氧化作用，而且还可以起到预防骨质疏松、多种癌症、心血管疾病等功效[2]。大豆异黄酮母核为3-苯并吡喃酮，以游离型的苷元和结合型的糖苷形式存在[3]。糖苷占大豆异黄酮总量的97%～98%，苷元仅占大豆异黄酮总量的2%～3%。糖苷主要有大豆苷（daidzin）、料木苷（genistin），苷元主要有染料木素（genistein）、大豆苷元（daidzein）[4]。目前，紫外吸收法、气相色谱法、高效液相色谱法等[5-7]是大豆异黄酮的主要检测方法。其中，紫外吸收法灵敏度不高，只能测定大豆异黄酮总量。气相色谱法前处理复杂，需要对异黄酮进行衍生。高效液相色谱法具有样品分离度好、定量准确、操作容易、处理简单等优点[6]。因此，本文建立一种超高效液相色谱法，用于测定大豆中大豆异黄酮含量，以提供一种快速简便、灵敏度高的大豆异黄酮含量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆（市购），粉碎备用。

大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）（纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Merck公司，为色谱纯；乙酸，Merck 公司，为分析纯；超纯水，一级水。

1.2 仪器与设备

ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色谱仪，Waters 公司；2998 Photodiode Array Detector 光电二极管阵列检测器，Waters 公司；涡旋混合器，IKA公司；超声波仪，宁波东和超声波科技有限公司；恒温干燥箱，上海宏泰仪器设备厂；高速离心机，HITACHI 公司；分析天平，OHAUS 公司；PURELAB Chorus 超纯水机，ELGA 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准工作液配制

标准储备液：用分析天平准确称取大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷0.01 g，置于100 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并定容至刻度，制成0.1 mg·mL-1标准储备液。

标准工作液：临用时，根据实际需要，对标准储备液用进行适当的浓度稀释，得到标准工作液，保存于冰箱中备用。

1.3.2 样品处理

用分析天平准确称取试样10 g，精确到0.01 g，将试样置于100 mL 离心管中。加入70%甲醇定容，涡旋混合60 s，超声波仪中振荡20 min，然后放入离心机内，在离心机中以9 000 r·min-1离心5 min，取离心上清液，移至100 mL 容量瓶中。用0.45 μm 滤膜过滤，加入70%甲醇补至相应刻度。吸取10 mL 样品，将其置于100 mL 离心管中，恒温干燥箱浓缩至干，用乙腈-0.2%乙酸溶液将浓缩样品定容至5 mL，再用0.45 μm 滤膜过滤，移至进样瓶中。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEHC C18柱[8]（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），进样量为5 μL；流速为0.15 mL·min-1；经全波长扫描大豆异黄酮成分，并比较了不同波长的峰，结果发现，在260 nm 波长处灵敏度高，因此检测波长选择260 nm；大豆异黄酮的保留值和分离度都受柱温的影响，为了避免柱温较高，缩短保留时间，选择30 ℃柱温；由于大豆异黄酮极性较弱，为实现完全分离，通过研究乙腈和不同浓度的乙酸对大豆异黄酮成分保留值和分离度的影响，流动相选用乙腈-0.2%乙酸，梯度洗脱条件如表1所示。

表1 分离梯度程序表

2 结果与分析

2.1 线性关系及检出限

吸取一定量的大豆异黄酮标准工作液，用甲醇水溶液将其稀释成1.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.0 μg·mL-1、9.0 μg·mL-1以及0 μg·mL-1的溶液，经处理后进行测定，每个大豆异黄酮成分重复测定3 次。设定浓度为横坐标X，大豆异黄酮成分3 次测定峰面积平均值为纵坐标Y，对其进行线性回归，得到大豆异黄酮成分的标准曲线，如表2 所示。线性检测范围均为1.0 ～9.0 μg·mL-1。

表2 大豆异黄酮成分标准曲线表

2.2 精密度试验

分别精密吸取同一标准工作液，连续平行进样5 次，测定4 种大豆异黄酮成分的峰面积，如表3 所示。大豆苷的RSD 为0.28%，大豆苷元的RSD 为0.22%，染料木素的RSD 为0.32%，染料木苷的RSD 为0.26%，结果表明仪器精密度良好。

表3 大豆异黄酮成分精密度表

2.3 稳定性试验

在样品溶液中，加入标准工作液，每隔4 h 进一次样，进样6 次，测定4 种大豆异黄酮成分的峰面积，如表4 所示。大豆苷的RSD 为0.33%，大豆苷元的RSD 为0.25%，染料木素的RSD 为0.88%，染料木苷的RSD 为0.46%，结果表明，标准工作液在24 h 内稳定。

表4 大豆异黄酮成分稳定性表

2.4 回收率试验

回收试验时，在样品溶液中，准确加入大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷的标准工作液，重复进样5次，得到4种大豆异黄酮成分的回收率，如表5所示。结果表明，大豆苷回收率为97.6%，RSD 为1.8%；大豆苷元回收率为98.2%，RSD 为1.7%；染料木素回收率为98.6%，RSD为2.1%；染料木苷回收率为97.6%，RSD 为1.4%。

表5 大豆异黄酮成分回收率表

2.5 样品测定

精确吸取样品溶液5 μL，对大豆异黄酮含量进行检测，计算得出大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷含量，具体如表6 所示。

表6 4 种大豆异黄酮含量表

3 结论

大豆异黄酮在我国药品、保健品、食品等行业应用广泛，为满足日常大豆异黄酮检测的需求。通过试验建立了一种超高效液相色谱法检测方法，用于测定大豆中大豆异黄酮的含量，该超高效液相色谱法采用BEHC C18色谱柱，能够在较大的样品流量下，保证色谱柱的柱效，实现快速分离，并保证峰形尖锐、对称。线性关系、精密度、稳定性、回收率的试验结果表明，将该超高效液相色谱法用于检测大豆异黄酮的含量，可以提高检测的灵敏度和稳定性。从样品检测结果得知，大豆中大豆异黄酮成分中，大豆苷含量最高，为352 μg ·g-1，大豆苷元含量最低，为19.5 μg·g-1。