酯化反应-气相色谱-质谱联用法测定茶叶中氯酞酸残留

◎ 巫立健

（南平市食品药品检验检测中心，福建 南平 353000）

氯酞酸为苯甲酸类除草剂，也是芽前除草剂敌草索在植物体内的主要代谢产物，通常用于控制禾本科杂草和阔叶杂草[1]。美国环保署针对敌草索除草剂发布了职业和居民暴露评估报告，评估结果认为该农药对职业工人及接触农药的相关人员存在健康风险，其中大鼠甲状腺毒性测试报告研究表明，敌草索对大鼠具有潜在的内分泌干扰特性，可能会造成孕妇胎儿甲状腺素紊乱，从而对胎儿产生不利的健康风险[2]。因此，建立一种植物源食品中氯酞酸残留量的分析方法十分必要。

2021 年3 月，国家卫生健康委员会等3 部委联合发布《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021），其中在蔬菜、水果、食用菌等食品上新增的检测项目氯酞酸尚无配套的检测标准，经查也没有可供参考的食品安全国家标准。氯酞酸水溶性好、极性强，导致其在反相液相色谱柱上无保留，使用液相色谱法检测时需在流动相中使用离子对试剂磷酸四丁胺来解决强极性化合物难保留的问题[3]；选用高选择性的质谱检测器，一定程度上可以克服氯酞酸在反相液相色谱柱上的保留难题，但目前关于液相色谱-质谱法检测氯酞酸的研究较少[4-5]。

作为农药残留的重要检测手段，气相色谱、气相色谱-质谱技术只能对挥发性组分进行分析，不能直接用于难挥发、热不稳定化合物及生物农药等多种结构类型的农药多残留的筛选测定。氯酞酸挥发性低和极性强，因此不能直接使用气相色谱法进行分析，需要先进行衍生化反应[6-7]，此类检测方法前处理过程复杂、耗时长、成本高，不适合大批量的样品检测。本方法拟采用基于芳香基羧酸与卤代烃的酯化反应对茶叶中的氯酞酸进行提取、衍生化、净化后，使用气相色谱-串联质谱法进行分析，以期为茶叶中氯酞酸的残留检测提供快速、简便的分析方法[8]。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

茶叶为市售；乙腈，色谱纯；Copure® QuEChERS净化管（货号COQ015020-TJ，150 mg N-丙基乙二胺键合硅胶吸附剂+15 mg 石墨化炭黑吸附剂+900 mg硫酸镁），深圳逗点生物技术有限公司；氯酞酸标准品（10 mg，纯度大于98%），天津阿尔塔科技有限公司；碘乙烷，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ8000 Evo 气相色谱-三重四极杆串联质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；BP211D 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；3-18 KS 台式高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；TurboVap 多功能全自动样品浓缩仪，瑞典Biotage 公司；Milli-Q Advantage Direct 16 超纯水制备系统，德国默克密理博公司。

1.3 溶液配制

①氯酞酸储备溶液。称取10 mg（精确至0.1 mg）氯酞酸标准品，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到浓度为1 000 μg·mL-1的氯酞酸储备液。②氯酞酸中间液。准确移取100 μL氯酞酸标准储备液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到浓度为10 μg·mL-1氯酞酸中间液。③氯酞酸工作液。准确移取500 μL 氯酞酸中间液至10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到浓度为500 ng·mL-1的氯酞酸工作液，-18 ℃避光保存。④系列基质工作溶液的具体配制方法。取2 g 茶叶空白试样，分别加入20 ng、40 ng、80 ng、120 ng、160 ng 和200 ng 的氯酞酸标准品，再按1.4 样品前处理方法提取、衍生、净化后，制成氯酞酸质量浓度分别为5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、30.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基质工作溶液。

1.4 样品前处理方法

①提取。称取2 g茶叶试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入4.0 mL 超纯水涡旋混匀，静置复原30 min，待茶叶试样完全吸收加入的水后加入10 mL乙腈，盖上离心管盖，剧烈振荡提取1 min，转移试样到台式高速冷冻离心机，5 000 r·min-1离心5 min。②衍生。吸取全部上清液至25 mL 带盖玻璃瓶中，加入0.5 mL 衍生试剂碘乙烷后加瓶盖密封后摇匀，转移至60 ℃恒温水浴反应30 min，取出，冷却，待净化。③净化。吸取6 mL 衍生后上清液加到Copure®QuEChERS 样品净化管中，混匀后推出2.5 mL 澄清滤液于10 mL 试管中，转移至40 ℃恒温水浴，N2气吹扫至近干，然后加入1 mL 乙酸乙酯复溶样品，过微孔滤膜，用于测定。

1.5 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：农残专用石英毛细管柱Thermo Pesticides II（30 m×0.25 mm，0.25 µm，带5 m 保护，美国赛默飞世尔科技公司）；柱温：100 ℃；程序升温过程：100 ℃保持0.5 min，以20 ℃·min-1程序升温至260 ℃，再以40 ℃·min-1升温至300 ℃，保持5.0 min；载气：氦气，纯度≥99.999%，载气流速1.0 mL·min-1；碰撞气：氮气，纯度均≥99.999%；进样口温度：220 ℃；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

（2）质谱条件。电离能量：70 eV；离子源温度、传输线温度：280 ℃；质谱扫描方式：多反应监测模式，质谱监测离子及相关参数见表1。

表1 氯酞酸二乙酯（氯酞酸衍生物）的定量离子对、定性离子对、碰撞能和离子丰度比表

2 结果与分析

2.1 衍生化条件的优化

目前测定氯酞酸的方法主要分衍生和不衍生两种，考虑到不衍生的方法对仪器要求高，本方法采用碘乙烷作为衍生剂，考察不同反应温度和时间对衍生效率的影响。由图1 可知，在25 ℃条件下反应30 min，衍生化反应十分缓慢，相对响应强度为19.9%。随着反应温度的升高，衍生化反应加快，40 ℃条件下反应30 min，相对响应强度为达到65.0%，反应60 min 相对响应强度为达到89.1%。在60 ℃条件下，反应时间从5 min 增加到30 min，随着反应时间的增加，峰面积不断增加；反应30 min 后峰面积增加不明显，表明底物已经完全衍生化。实验最终选择60 ℃反应30 min 作为衍生化条件。

图1 不同反应温度和时间条件下氯酞酸衍生化效率结果比较图

2.2 净化方法

茶叶基质复杂，样品前处理过程中得到的提取液中除了目标物，还有大量的天然色素、游离氨基酸、生物碱、茶多酚等物质，可能会对检测结果造成干扰。本方法使用Copure® QuEChERS 净化管对衍生化实验的反应溶液进行净化处理，可以有效消除样品基质的干扰。由图2 可知，未净化处理的绿茶样品提取液中存在大量的杂质峰，经过净化处理的茶叶样品提取液基线平稳，杂质峰少。

图2 红茶空白、红茶加标、绿茶空白、绿茶加标及未净化绿茶样品中氯酞酸二乙酯总离子流色谱图

2.3 方法的线性范围及定量限

取红茶空白、绿茶空白试样，移取适量的氯酞酸标准工作液并加入样品，再按1.4 样品前处理方法提取、衍生、净化后，按1.3 项方法配制氯肽酸系列溶液，供气相色谱-质谱联用仪测定。结果表明，红茶和绿茶基质在5.0 ～50.0 ng·mL-1时，氯酞酸质量浓度与其峰面积呈现良好的线性关系，红茶基质线性方程为Y=1.313×104X-2.402×104，绿茶基质线性方程为Y=9.681×103X-1.479×104，线性相关系数均大于0.999。通过在空白基质中添加氯酞酸标准溶液，定义当氯酞酸标准物质产生信号为3 倍信噪比时浓度为检出限，10 倍信噪比时浓度为定量限，测得本方法检出限为0.000 05 mg·kg-1，定量限为0.000 15 mg·kg-1，均能满足《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）中茶叶分类下氯酞酸临时限量0.01 mg·kg-1的检测要求。

2.4 回收率及精密度

采用标准物质添加回收的方法，在不含氯酞酸的空白茶叶试样中添加0.01 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-13 个浓度水平的氯酞酸，每个添加浓度平行测定6 次，考察方法精密度，结果见表2。在不同的氯酞酸添加浓度下，茶叶试样的平均回收率为75.3%～90.2%，相对标准偏差为2.5%～8.7%，结果表明本方法测定复杂基质中氯酞酸具有良好的回收率和精密度，能够满足农药残留测定的要求。

表2 氯酞酸基质加标回收率和精密度表

3 结论

通过对氯酞酸衍生化条件进行筛查优化，本文成功建立了一种衍生化法检测茶叶样品中氯酞酸残留含量的方法。采用碘乙烷作为衍生剂，在反应温度为60 ℃的条件下反应30 min 后，采用Copure® QuEChERS净化管净化样品中的杂质，排除了基质效应对结果的干扰。结果表明，红茶和绿茶基质在5.0 ～50.0 ng·mL-1时，氯酞酸质量浓度与其峰面积呈现良好的线性关系，定量限为0.000 15 mg·kg-1。在茶叶样品中添加0.01 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-13 个浓度水平氯酞酸，平均回收率为75.3%～90.2%，相对标准偏差为2.5%～8.7%。该方法简单、回收率好、精密度高，实现了对茶叶中氯酞酸的精确定量分析，为茶叶中氯酞酸的分析确证提供依据，也可以作为其他方法的辅助手段。