基于网络药理学探讨桂枝-甘草药对治疗窦性心动过缓的作用机制

杜欣桐，张世亮

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.山东中医药大学附属医院，山东济南 250014）

窦性心动过缓（sinus bradycardia，SB）是缓慢性心律失常疾病的一种，当窦房结自律性降低时，由窦房结产生的冲动低于正常的范围，即低于60次／分。心率减慢是正常衰老和疾病进展的一部分，因此SB在老年人中更为常见［1］。目前，现代医学对SB缺乏有效的治疗手段，一般通过异丙肾上腺素、氨茶碱、阿托品等药物提高心室率［2］。大量临床研究发现，长期服用这些抗心律失常的药物，可能会导致其他心律失常。近年来，随着医疗与科学技术的不断发展，植入心脏起搏器作为一种新兴的治疗手段，已经成为治疗缓慢性心律失常的重要方式，在改善心功能、降低心源性猝死率、提高生活质量方面起到积极作用，但其长期疗效依然有待进一步研究。此外，受植入起搏器的手术风险、术后并发症及患者经济实力等因素的影响，起搏器在临床上的应用受到限制［3］。中医从整体角度出发，以辨证论治为原则，结合现代医学辨识SB，并在治疗上取得了显著疗效。赵晓敏等［4］通过分析近20年中医治疗缓慢性心律失常的文献，发现心肾阳虚证和心阳亏虚证为心律失常的常见证型。郭艳琼等［5］通过聚类分析发现治疗SB的中药中使用频率较高的前两味中药分别是甘草、桂枝。现代研究表明，甘草、桂枝中的部分成分在抗心律失常、扩张血管等方面发挥作用［6-7］。通过网络药理学方法构建“药物-靶点-基因-疾病”的相互作用网络，分析、预测多种药物成分共同治疗疾病的机制，其系统性与中医学的整体辨治观念，以及中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用于人体的原理不谋而合［8］。本研究采用网络药理学的方法，通过对药物的化学成分、作用靶点和信号通路进行分析，探究桂枝-甘草药对干预SB的作用机制。

1 资料与方法

1.1 桂枝、甘草化学成分及靶点获取 以“桂枝”“甘草”为关键词，检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https：／／tcmspw.com／tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选条件，获得桂枝、甘草的活性成分，并通过挖掘文献对获得的数据进行验证和补充。利用本草组鉴平台（HERB，http：／／herb.ac.cn／）进行药物成分靶点预测。

1.2 SB疾病靶点获取 以“sinus bradycardia”为关键词，检索HERB数据库，汇总整理后得到SB疾病的相关靶点。

1.3 桂枝-甘草药对预测靶点与SB疾病靶点的交集靶点筛选 将桂枝、甘草药物成分预测靶点和SB疾病靶点导入InteractiVenn（http：／／www.interactivenn.net／），并绘制Venn图。

1.4 桂枝、甘草成分预测靶点与SB靶点蛋白互作网络构建 为阐明靶点蛋白之间的相互作用，将药物成分预测靶点和SB疾病靶点上传至STRING 数据库（https：／／string-db.org），限制物种为“homo sapiens”，设置靶点置信度分值为0.40，隐藏无相互作用关系的靶点后，以TSV 格式将靶点互作数据导出，导入Cytoscape3.9.1软件中，绘制蛋白与蛋白相互作用（PPI）网络图，并对其进行分析。

1.5 交集靶点富集分析 将交集靶点导入Metascape平台（https：／／metascape.org／gp／index.html），限制物种为“homo sapiens”，进行基因本体（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。其中，GO 富集分析由生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3个部分组成。以P＜0.01为筛选条件，选取符合条件的前20 条数据，利用微生信平台（http：／／www.bioinformatics.com.cn／）对其进行可视化处理。

1.6 成分-靶点-通路网络图的构建 将桂枝、甘草药对化学成分与交集靶点对应关系、交集靶点与KEGG通路对应关系进行映射，导入Cytoscape3.9.1软件绘制桂枝-甘草药对有效成分-SB疾病靶点-通路网络图。利用Cytoscape 3.9.1 内置的Network Analyzer功能，分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，获得节点的连接度、介度、紧密度相关信息，并判断核心靶点及干预SB的主要活性成分。

2 结果

2.1 桂枝、甘草化学成分收集和成分靶点预测 经检索和筛选，获得桂枝化学成分7 种，甘草化学成分92种。其中，谷甾醇（sitosterol）为两者共同包含的化合物。预测桂枝对应的成分靶点88个，预测甘草对应的成分靶点1 756个，将两者靶点合并且去重后获得245个成分靶点。

2.2 SB疾病靶点 检索HERB数据库后共获得SB疾病相关靶点570个。

2.3 桂枝、甘草成分靶点与SB靶点的交集靶点 将245个成分靶点与570个SB疾病靶点导入Interacti Venn后，共获得交集靶点52个。见图1（扫描标题右侧二维码查看图片）。

2.4 交集靶点的蛋白与蛋白相互作用（PPI）网络构建将52个交集靶点上传至STRING数据库，获得PPI网络信息，并利用Cytoscape 3.9.1软件优化靶蛋白PPI网络，见图2（扫描标题右侧二维码查看图片）。图2提示IL6、TNF、IL1B、CXCL8、MMP9、CCL2、EGF等靶点可能为桂枝-甘草药对治疗SB 的潜在核心靶点。

2.5 交集靶点富集分析结果 通过Metascape数据库进行GO 和KEGG 富集分析，筛选后共获得BP 20项，主要与血液循环、系统过程的调节、细胞增殖的负调控、细胞脂质的反应等相关；CC 11项，涉及膜筏、突触后膜、过氧化物酶体等；MF 12项，包含细胞因子受体结合、G蛋白偶联胺受体活性、血红素结合等。与SB相关的KEGG 通路主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、癌症途径、钙信号通路、HIF-1信号通路、Fox O 信号通路等。利用微生信平台对GO和KEGG富集分析结果进行处理，分别得到GO 富集分析图（见图3，扫描标题右侧二维码查看图片）和KEGG通路富集分析气泡图（见图4，扫描标题右侧二维码查看图片）。

2.6 成分-靶点-通路网络图的构建 运用Cytoscape 3.9.1构建“桂枝-甘草药对成分-交集靶点-通路”网络图，并通过其内置工具分析网络拓扑学参数，得到核心成分（槲皮素、山柰酚等）及核心作用靶点（ESRI、AR、NOS2、CALM3、ACN5A等）。桂枝、甘草与窦性心动过缓成分-靶点-通路网络图见图5（扫描标题右侧二维码查看图片）。桂枝、甘草与窦性心动过缓成分-靶点-通路网络中成分节点参数见表1。桂枝、甘草与窦性心动过缓成分-靶点-通路网络中重要靶点网络节点参数见表2。

表1 桂枝、甘草活性成分-窦性心动过缓疾病靶点-通路网络中成分节点参数

表2 桂枝、甘草活性成分-窦性心动过缓疾病靶点-通路网络中重要靶点网络节点参数

3 讨论

中医将SB归于“心悸”“迟脉证”“怔忡”等范畴，认为该病多因体虚劳倦、情志失调、外邪所伤及药食不当等导致气血阴阳不足，心失濡养，或邪滞心脉，扰乱心神而发；病机以阳虚为主，此外亦有血瘀、痰浊、气滞等，总属本虚标实之证；临床用药以补气、温通为主要方法。桂枝、甘草为临床常用的药对，如在《伤寒论》治疗心悸的炙甘草汤、桂枝甘草汤中就有应用。甘草味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，可补心益气、复脉定悸，尤擅治疗因心气虚导致的心悸气短、脉结代。桂枝味辛甘，性温，归心、肺、膀胱经，可温通心脉，补助胸阳，止悸。现代药理学研究发现，甘草中含有的甘草次酸及黄酮类成分可以降低心律失常的发生风险［9］；桂枝中的部分成分能够有效改善冠状动脉血流循环、增加心肌营养，为抗心律失常作用提供物质基础［10］。

本研究结果推测，桂枝、甘草治疗SB的活性成分为槲皮素、山柰酚、金雀花碱、紫檀素等。槲皮素可能通过抑制钠离子（Na＋）、钙离子（Ca2＋）内流，促进钾离子（K＋）外流，保护心肌细胞膜上Na＋-K＋-ATP酶的功能等多种途径对抗心律失常［11］。山柰酚可通过抑制核因子κB（NF-κB）从而抑制炎症因子、趋化因子和酶的表达，同时可以通过抑制血管紧张素转化酶，引起动静脉血管扩张，并起到抗血小板聚集和抗血栓形成的作用［12］。金雀花碱在阻止动脉粥样硬化形成、减少血栓发生、增加组织血流量等心血管疾病方面均有积极作用［13］。

桂枝、甘草治疗SB的核心靶点主要包括ESR1、AR、NOS2、CALM3、SCN5A。雌激素受体1（ESR1）的主要核受体为ERα，广泛分布于心肌细胞、心脏成纤维细胞、血管内皮细胞等，基本作用包括调节免疫反应、抗炎、抗动脉粥样硬化、改善心血管病变［14］。雄激素受体（AR）在心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中均有表达，因此与心血管相关疾病关系密切。AR 通过与雄激素相结合发挥其生物学效应。研究表明，雄激素可直接作用于心室肌细胞，改变心室肌细胞膜的通透性，影响K＋外流，从而调节心室肌复极化，故雄激素水平的改变可以导致心血管不良事件的发生［15］。一氧化氮合酶（NOS）2属于NOS家族。当NOS被激活时，一氧化氮（NO）合成增加，NO 作为细胞之间的通讯物质，在细胞免疫、调节血管功能和神经信号的传导等生理过程中充当重要的信使分子，促进多种细胞的协同工作［16］；当NOS被抑制时，可能导致缺血再灌注损伤，心肌细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）含量降低，会增加心律失常的可能。当心肌缺血时，钙泵活性降低，细胞膜上的Na＋-Ca2＋交换增多，胞内Ca2＋浓度升高甚至超载，这被广泛认为是心律失常的机制之一。钙调蛋白3（CALM3）通过调控Ca2＋通道，调节心肌细胞内外的Ca2＋浓度，防止Ca2＋超载，发挥抗心律失常的作用［17］。钠电压门控通道α亚基5（SCN5A）为全身钠通道的一种。Na＋通道在工作时有静息态、激活态和失活态3种状态。在静息态时，Na＋通道受到超过阈值的电刺激，使心肌细胞兴奋并产生动作电位，同时帮助传导，随后Na＋通道失活，通道重新进入静息态。药物和基因突变等多种因素会影响通道构象的改变，进而影响其功能，导致心律失常的发生［18］。

KEGG富集分析结果显示，桂枝、甘草作用于SB主要涉及流体剪切应力与动脉粥样硬化、钙信号通路、HIF-1信号通路、Fox O 信号通路等多种信号通路，可能具有影响血管内皮功能、抗细胞缺氧损伤能力等。切应力通过细胞膜上的受体、胞间连接信号、基底黏着斑蛋白参与调节内皮细胞增殖、迁移、凋亡等生物过程，可以影响与促进动脉粥样硬化斑块生成有关的基因的表达。低切应力能增强NF-κB的活性，增加钙化基因、炎症细胞因子等基因的表达，抑制eNOS基因，导致NO的产生减少，从而引发内皮功能障碍［19］。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是缺氧过程中的重要分子，能够促进血管生成、重建细胞代谢途径等，使组织细胞适应低氧环境。机体处于缺氧时，HIF-1能促进NOS基因表达，减少心肌细胞的凋亡，降低心肌损伤［20］。因此，HIF-1在缺血性疾病中起到至关重要的作用。Fox O通路参与细胞凋亡、周期调控等多种细胞生物过程，可以调节氧化应激反应，并有抗老化的作用，Fox O 蛋白活性增加会产生氧化应激抵抗，减少细胞凋亡，降低心血管疾病的发病率［21］。

本研究通过网络药理学方法探索桂枝-甘草药对治疗SB的作用机制，发现桂枝-甘草药对中有多种活性成分作用于疾病靶点，并参与多种信号通路的调控。然而，依靠上述方法探究药物作用机制仍然需要思考一些问题，如中药配伍时剂量不同，其所含单体成分浓度亦有差异，进而导致不同的药效，且多数中药的药效成分及起效形式等尚未明确，不同成分之间还存在协同、拮抗作用，难以全部纳入分析。现有研究大多以OB≥30%、DL≥0.18为标准进行有效成分筛选，然而将OB及DL作为评判成分活性程度的唯一指标过于绝对，如甘草中的主要成分甘草酸（OB＝19.62%，DL＝0.11）、桂枝中的主要成分桂皮醛（OB＝31.99%，DL＝0.02）无法被上述策略筛选，普遍存在于各种中药中的槲皮素、山柰酚等成分却因为具有良好的OB、DL值，被推测为重要成分。此外，中药也可以改变肠道菌群。肠道微生物能通过生物转化将中药成分代谢为其他活性物质，在药物代谢动力学和药物效应动力学方面起重要作用，如甘草酸因分子量较大，口服后不易通过肠道屏障进入血液发挥效用，但经肠道菌群转化后，其代谢产物甘草次酸的生物利用度更高［22］。这种动态关联在网络药理学“成分-靶点-疾病”的静态网络中难以体现。现阶段网络药理学已成为研究中医药药理基础与作用机制的热门工具，为临床药物优化提供支持，但由于自身局限性，仍需要通过动物实验、现代基础研究等方式验证和丰富其合理性，减少同质化。