基于网络药理学研究浙贝母-山慈菇药对干预甲状腺癌的作用机制

侯鹏霄，樊茜

（山西省肿瘤医院／中国医学科学院肿瘤医院山西医院／山西医科大学附属肿瘤医院，山西太原 030013）

我国甲状腺癌的发病率呈持续上升趋势，研究表明，我国甲状腺癌的发病率为20.3／10万，是目前常见的内分泌系统恶性肿瘤［1］。山西省肿瘤医院中医科张勇主任通过对治疗甲状腺癌的经验处方进行总结、提炼，发现具有化痰消痈、清热解毒功效的药对——浙贝母、山慈菇在治疗甲状腺癌的过程中能协同增效，有效控制肿瘤的发展。浙贝母为苦寒之品，功擅清热解毒、化痰消肿散结。现代药理研究证实，浙贝母含有多种生物碱、总皂苷、黄酮类及多糖类成分，有祛痰止咳、抗炎杀菌、止痛、抗肿瘤等功效，还能逆转肿瘤耐药［2-3］。山慈菇性寒，味甘、微辛，可清热解毒，散结消痈止痛，临床用于治疗各种疮痈肿毒、瘰疬痰核［4］。吴俊林［5］在甲状腺癌细胞株培养基中添加山慈菇提取物，发现处理后的甲状腺癌细胞的NIS mRNA表达上调，说明山慈菇可抑制甲状腺癌细胞的增殖。中医认为，甲状腺癌的基本病机是气滞、痰凝、血瘀［6］。浙贝母有开郁散结之力，山慈菇可化痰散结解毒，二者相须为用，协同增效，共奏解毒化瘀散结之功。研究表明，山慈菇、浙贝母均有抗肿瘤作用，但对二者干预甲状腺癌的机制尚不明确［2，7］。网络药理学结合医学、生物信息学、计算机科学等多学科，探索药物对疾病靶点网络的干预和影响，对组合药物研究有较大的帮助［8］。本研究利用网络药理学的相关研究方法，以山慈菇-浙贝母药对的核心成分为基础，探讨其治疗甲状腺癌的机制，为后续研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 山慈菇、浙贝母成分筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）中分别检索浙贝母、山慈菇的化学成分，以口服利用度（OB）≥30%及类药性（DL）≥0.18为筛选条件初步筛选出浙贝母、山慈菇活性化合物。

1.2 药物相关靶点的收集 获得浙贝母、山慈菇的预测靶点，并根据已发表的文献报道补充已知的但数据库中没有预测到的靶点，然后通过UniProt数据库（Universal Protein，https：／／www.uniprot.org／）检索获得的靶点信息，进一步规范靶点。

1.3 甲状腺癌相关靶点筛选 在疾病靶点数据库GeneCards（https：／／www.genecards.org／）和OMIM（https：／／omim.org／）中以“Thyroid Carcinoma”“Thyroid Cancer”为关键词进行检索，将检索结果合并，剔除检索到的重复数据，得到甲状腺癌的相关靶点。

1.4 药物-成分-靶点网络构建 运用Cytoscape 3.7.1软件建立浙贝母-山慈菇药对治疗甲状腺癌的药物-成分-靶点网络。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建与分析 使用Cytoscape 3.7.1软件中的Biso Genet建立“药物成分靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络”和“甲状腺癌靶点PPI网络”。通过软件中的“Mergre”选项取交集，最终得到药物成分靶点及甲状腺癌靶点的交集网络。使用“Analyze network”选项分析网络拓扑参数，分析的内容为Degree、Betweenness、Closeness和Neighborhood Connectivity（NC）。筛选关键靶点，并从取得的关键靶点中以≥这4个指标的中位数为界，筛选出药物活性成分和甲状腺癌关系较为密切的关键靶点，并对结果进行可视化呈现。

1.6 GO和KEGG功能富集分析 将上述研究中得到的核心靶点输入Metascape数据库（http：／／metascape.org）中进行核心靶点的基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能通路富集分析。结果以气泡图展示。

2 结果

2.1 浙贝母、山慈菇有效成分 以OB≥30%、DL≥0.18筛选后，浙贝母得到7个有效活性成分，山慈菇得到3个有效活性成分。经查阅文献，浙贝母中补充贝母素甲、贝母素乙。浙贝母-山慈菇药对共有11个有效活性成分，其中共有1个活性成分。见表1、2。

表1 浙贝母主要成分信息表

表2 山慈菇主要成分信息表

2.2 药物相关靶点 山慈菇获得50个靶点，浙贝母获得68个靶点，二者合并后共获得75个靶点。

2.3 相关靶点收集 在OMIM 数据库中，采用“Thyroid Cancer”为关键词检索得到相关靶点612个，采用“Thyroid Carcinoma”为关键词检索得到277个相关靶点，合并后有838个相关靶点。在GeneCards数据库中，采用“Thyroid Cancer”为关键词检索得到11 820个相关靶点，采用“Thyroid Carcinoma”为关键词检索得到10 088个相关靶点。对GeneCards数据库获得的靶点根据经验选定“Relevance score”＞8.62为界线，去掉重复项，最终获得相关靶点1 703个。将2个数据库得到的靶点进行合并，并删除重复项，最终得到2 357个靶点。

2.4 药物-成分-靶点网络模型构建 将得到的药物活性成分、成分作用的基因靶点及甲状腺癌的基因靶点交集输入Cytoscape中，得到的药物-成分-靶点图中共有87个节点、176条边。网络图中蓝色节点表示药物，紫色节点表示活性成分，黄色节点表示药物共有的活性成分，红色节点表示药物成分作用的靶点。经网络拓扑学分析显示：药对的4种活性成分可以和10个以上的靶点相连接，分别是β-谷固醇（Degree＝73）、豆甾醇（Degree＝32）、2-甲氧基-9，10-二氢菲-4，5-二醇（Degree＝31）、天竺葵色素（Degree＝16）（扫描题目右侧二维码查看图1）。

2.5 基于Cytoscape的PPI网络构建 得到与药物活性成分具有直接或间接相互作用关系的靶点1 933个，关系网络有34 885条连接线，得到与甲状腺癌有直接或间接相互作用关系的靶点12 979个，关系网络有243 144条连接线。将上述2个PPI网络通过Cytoscape中的Intersection功能获取交集，得到1个包含1 875个靶点、34 534条相互作用关系的网络。在获得的交集网络中，计算得出Degree的中位数为21，以两倍中位数为界筛选出Degree≥42的下级网络，该网络有519个靶点，共计16 618个相互作用关系。因靶点数目较多，需要进一步再次筛选该下级网络。计算得出该网络的Degree、Betweenness、Closeness、NC 的中位数分别为73、212.582、0.522、95.872，以Degree ≥73、Betweenness≥212.582、Closeness≥0.522、NC≥95.872为筛选条件，得到关键蛋白靶点96个，存在相互作用关系972条（扫描题目右侧二维码查看图2）。

在96个关键靶点中，前10个与活性成分和甲状腺癌均直接相关的靶点分别为NPM1（Degree＝210）、HSPA5（Degree＝206）、HDAC5（Degree＝169）、HNRNPA1（Degree＝161）、HUWE1（Degree＝157）、HSPA4（Degree＝153）、PRKDC（Degree＝147）、TUBB（Degree＝146）、HSPB1（Degree＝134）、PARP1（Degree＝134）。Degree值最高的2个靶点分别为NPM1和HSPA5，可以认为这2个靶点是浙贝母-山慈菇药对治疗甲状腺癌较关键的核心靶点（扫描题目右侧二维码查看图3）。

2.6 核心靶点GO 及KEGG功能富集分析 分别从细胞组分、分子功能、生物过程3个方面对核心靶点进行GO及KEGG功能富集分析，结果见图4（扫描题目右侧二维码查看）。其中细胞组分主要与核糖核蛋白复合物、蛋白质-DNA复合物、核斑点、核染色体等有关，见图4A（扫描题目右侧二维码查看）。分子功能主要与组蛋白脱乙酰酶结合、泛素蛋白连接酶结合、激酶结合、转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合、钙粘蛋白结合、ATP 依赖性活性、染色质结合等功能有关，见图4B（扫描题目右侧二维码查看）。生物过程与调节细胞对压力的反应、DNA代谢过程、蛋白质稳定性调节、细胞酰胺代谢过程的正向调节、核糖体生物发生等功能有关，见图4C（扫描题目右侧二维码查看）。KEGG信号通路富集主要包括新型冠状病毒感染、细胞凋亡、剪接体及缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路和细胞周期等信号通路，见图4D（扫描题目右侧二维码查看）。

3 讨论

本研究首先对数据库进行数据挖掘，从浙贝母-山慈菇这一甲状腺癌常用药对中检索出11个活性成分和75个作用靶点。结合甲状腺癌的疾病相关靶点进一步构建药物-成分-靶点网络，推导出β-谷固醇、豆甾醇、2-甲氧基-9，10-二氢菲-4，5-二醇、天竺葵色素4个活性成分为浙贝母-山慈菇药对干预甲状腺癌的主要活性成分。

有研究表明，β-谷甾醇可以阻断p53-MDM2的结合，进而激活p53，最终使p53转移到细胞核，同时还可以抑制NF-κB途径。β-谷甾醇联合奥沙利铂在体内有协同抑制肿瘤的作用［9］。而豆甾醇通过PI3K-Akt信号通路可抑制卵巢癌细胞活性［10］。天竺葵色素可以诱导自噬，并且引发活性氧诱导的线粒体膜电位减少，进而引发G2／M 细胞周期停滞，还可以通过浓度依赖的方式减少p-PI3K 和p-AKT 的表达［11］。关于2-甲氧基-9，10-二氢菲-4，5-二醇的研究文献较少，但本次研究发现其能与多个靶点连接，表明其在抗肿瘤方面有潜在的活性，可以作为进一步研究的方向。

PPI网络中筛选出NPM1和HSPA5作为核心靶点。NPM1在细胞中的亚细胞定位主要在核仁，其能自由地通过细胞核膜到达胞质，对细胞生长和体内平衡具有关键作用［12］。NPM1的表达水平与肿瘤分期和预后显著相关。NPM1与翻译起始、核糖体、核糖体结构成分和RNA转运密切相关。NPM1的主要富集途径相关差异基因主要与m TORC1介导的信号通路、p53缺氧通路、癌症EGFR 信号通路、抗原激活β细胞受体BCR导致产生第二信使、有氧糖酵解和甲基化通路有关。NPM1的表达水平与β细胞和NK细胞呈负相关。NPM1的表达与1个m6A 修饰相关基因（YTHDF2）和5 个糖酵解相关基因（ENO1、HK2、LDHA、LDHB和SLC2A1）显著相关［13］。HSPA5编码的结合免疫球蛋白（BIP）主要存在于内质网中，负责将蛋白质转移至内质网，参与折叠内质网中的蛋白质底物、启动未折叠蛋白质反应（UPR）、协助内质网相关降解（ERAD）［14］。BIP在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和肝癌等多种组织和细胞类型的癌症中过度表达。此外，BIP过度表达与原发性癌细胞的增殖、转移、耐药性和化疗耐药性增强及总体临床结果不佳有关［15-16］。

GO功能富集结果显示，在细胞组分中，关键靶点与核糖核蛋白复合物、蛋白质-DNA 复合物、核斑点、核染色体等有关，主要与组蛋白脱乙酰酶结合、泛素蛋白连接酶结合、激酶结合、转录因子结合等分子功能有关。主要靶点涉及调节细胞对压力的反应、DNA 代谢过程、蛋白质稳定性调节、细胞酰胺代谢的正向调节、核糖体生物发生等多个生物过程。KEGG 功能富集分析结果显示，浙贝母-山慈菇药对治疗甲状腺癌所涉及的信号通路包括新型冠状病毒感染、细胞凋亡、剪接体及HIF-1信号通路和细胞周期、内分泌抵抗、紧密连接、神经营养因子通路、病毒致癌、非同源末端连接、肌萎缩侧索硬化、甲状腺激素信号通路、长寿调节途径（多物种）、糖酵解／糖异生、癌症中的转录失调、核质转运、核苷酸切除修复、AMPK 信号通路、mRNA 监测途径等。其中新型冠状病毒感染与多种甲状腺疾病密切相关［17］；HIF-1α通过诱导上皮间质转化，调节甲状腺癌细胞的Twist信号通路，进而增加细胞侵袭和细胞迁移［18］。AMPK通路在甲状腺乳头状癌中被高度激活，激活后的AMPK信号通路可抑制甲状腺癌细胞的增殖活动［19-20］。以上研究结果表明，浙贝母-山慈菇药对可通过多个靶点调节多条信号通路以发挥其对抗甲状腺癌的作用。

本研究结果显示，浙贝母-山慈菇药对干预甲状腺癌的机制复杂，其作用机制涉及多个靶点、多条信号通路而形成网状结构，具有联合发挥作用的特点。目前甲状腺癌的发病机制研究尚不明确，治疗上西医多采用手术、放射性碘等方法治疗甲状腺癌，但尚无针对晚期甲状腺癌有效的治疗方法。随着中医药的发展，中药逐渐应用于甲状腺癌的治疗中。本研究可为中药治疗甲状腺癌提供新的理论基础和治疗思路，但仍然有局限性，如中药在临床应用时多以复方的形式存在，药物之间的相互作用及肠道菌群等因素影响药物在肠道的吸收，网络药理学研究结果并不能直接指导临床实践，后续可进一步进行实验验证，发掘浙贝母-山慈菇药对治疗甲状腺癌的机制，为新药的研发提供支撑。