趋化因子CXC 亚家族受体4 在食管鳞癌组织中表达情况及预后价值分析

朱文强 黄 杰 蔡 彭 赵红雨 时雪玲 韩秀美 李多杰

蚌埠医学院第一附属医院放射肿瘤科，安徽蚌埠 233000

食管癌死亡率位居世界第6 位，东亚国家的食管癌发病率最高，其中我国的食管癌发病例数和发病率占比很大，我国面临着防治食管癌的严峻考验，其中食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）占我国全部食管癌患者90%以上[1-3]。近年来，食管癌的死亡率有所下降，但晚期食管癌的预后仍然较差，5年生存率约为20%，威胁食管癌患者远期生存的主要危险因素是侵袭和转移[4-7]。因此，找出准确判断食管癌侵袭、淋巴结转移的生物标志物，对ESCC 的诊疗及预后判断具有重要的临床价值。趋化因子CXC亚家族受体4（CXC subfamily receptor 4，CXCR4）属于G 蛋白偶联受体超家族，是趋化因子受体中与肿瘤细胞关系较为密切的一类。CXCR4 主要由缺氧、损伤的内皮细胞和周细胞表达，其在许多实体肿瘤组织中呈高表达状态，包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等[8-9]。通过参与机体信号转导，CXCR4 在胚胎发育、炎症及免疫反应、血管生成、造血调控等方面发挥重要作用，进一步介导肿瘤细胞的迁移和存活[10-11]。有研究发现，ESCC 患者癌组织中CXCR4 呈高表达状态，但有关CXCR4 表达水平和患者预后相关性的研究仍然存在部分空白及争议[12-13]。本研究旨在探索ESCC 组织的CXCR4 表达水平，分析其与ESCC 患者临床病理特征和预后之间的相关性，以期为ESCC 的诊疗提供新的临床线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院2018 年1 月至12 月107 例病理诊断为ESCC 患者作为研究组，纳入标准：①年龄≥18 岁，卡诺夫斯凯计分≥70 分[14]；②经手术病理检查确诊为ESCC；③已行食管癌根治术；④治疗期间病历资料完整；⑤ESCC 原发癌。排除标准：①合并其他严重慢性疾病，如肝、肾衰竭；②在院内诊治期间发生急性死亡；③穿孔、出血或全身多发转移。病历数据包括患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤侵犯深度、淋巴结转移情况等。于蚌埠医学院第一附属医院病理科标本储存库中取得本研究所包含的ESCC 患者的病理切片，另随机选取其中21 例患者的癌旁组织作为对照组。本研究经蚌埠医学院第一附属医院研究伦理审批委员会审批（2023YJS151）。

1.2 实验试剂

鼠抗人CXCR4 单克隆抗体（MAB172-100）及SP免疫组织化学试剂盒（DSFPD0）购自美国R&D Systems 公司；兔抗人单克隆抗体（E-IR-R217B）购自武汉伊莱瑞特生物公司。

1.3 标本处理

石蜡标本以4 μm 连续切片。石蜡切片常规脱蜡、水化，加一滴3%过氧化氢后室温下孵育15 min，对内源性过氧化物酶进行灭活；柠檬酸钠缓冲液PBS 进行抗原修复，滴加山羊血清封闭非特异性抗原；滴加一抗CXCR4（1∶100）4 ℃过夜；滴加二抗（1∶100），室温下孵育30 min，DAB 染色，苏木精复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1.4 结果判断

CXCR4 表达于癌细胞的细胞膜和细胞质，呈黄色、黄褐色。由2 名蚌埠医学院第一附属医院病理科医师采用双盲法进行观测，其对患者的临床病理参数和临床结果均不知情，在400 倍光镜下随机选取10个视野，在10 个视野中计数显示免疫反应的CXCR4 阳性染色细胞的数量，并计算阳性细胞的百分比。按阳性细胞百分率计分：阳性细胞≤5%记为0 分；＞5%～25%记为1 分；＞25%～50%，2 分；＞50%～75%记为3 分；＞75%记为4 分。按染色强弱计分：不着色记为0 分；黄色记为1 分；棕黄色记为2 分；棕褐色记为3分。通过将两项分值相乘，获得每例患者的最终免疫反应分数（immunoreactive score，IRS）。IRS＜3 分为阴性表达，IRS≥3 分为阳性表达[15]。

1.5 随访

院内治疗结束后将对研究对象进行长期随访，随访的形式为返院检查或电话随访。治疗结束后每3 个月随访1 次，2 年后每6 个月随访1 次，5 年后每年随访1 次，随访截止时间为2023 年10 月。随访内容包含完善的体检、胸部CT、腹部彩超等。

1.6 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验；计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验。使用Kaplan-Meier 生存曲线、log-rank 检验比较CXCR4 阳性表达和阴性表达患者的生存时间[总生存期（overall survival，OS）、无病生存期（disease-free survival，DFS）]。通过Cox 回归模型筛选影响ESCC 患者预后的相关因子。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CXCR4 表达水平比较

研究组CXCR4 阳性表达率为56.1%（60/107），对照组CXCR4 阳性表达率为0，研究组CXCR4 阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 两组CXCR4 表达（免疫组织化学染色，400×）

图2 不同CXCR4 表达水平ESCC 患者总生存期、无病生存期的生存曲线

2.2 不同病理参数ESCC 患者CXCR4 表达水平比较

不同年龄、分化程度、侵犯深度、淋巴结转移情况ESCC 患者癌组织中CXCR4 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同病理参数ESCC 患者癌组织中CXCR4 表达水平比较（例）

2.3 ESCC 组织中CXCR4 表达与预后的关系

CXCR4 阳性表达患者中位OS 为21.47 个月，CX CR4 阴性表达患者中位OS 为61.03 个月，CXCR4 阳性表达患者OS 低于阴性表达患者（log-rankχ2=43.575，P＜0.001）。CXCR4 阳性表达患者中位DFS 为18.81 个月，CXCR4 阴性表达患者中位DFS 为56.11个月，CXCR4 阳性表达患者DFS 低于阴性表达患者（logrank χ2=47.520，P＜0.001）。见图2。Cox 回归模型显示，肿瘤侵犯深度、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及CXCR4 表达情况是影响患者OS 和DFS 的独立危险因素（P＜0.05）。见表2～3。

表2 ESCC 患者OS、DFS 单因素Cox 回归分析

表3 ESCC 患者OS、DFS 多因素Cox 回归分析

3 讨论

食管癌一直是威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤，恶性程度高，早期食管癌症状不明显，晚期死亡率和转移率较高，预后不良[16]。因此，早期识别食管癌的高危人群和早诊早治的二级预防策略至关重要。CXCR4 作为肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，与多种肿瘤的发展和转移有关，包括肺癌、结肠直肠癌、原发性脑肿瘤（如胶质瘤）等[17-19]。Lu 等[20]的研究提出了ESCC 转移机制：CD133+CXCR4+细胞亚群有较强的增殖能力与侵袭能力，具有食管癌肿瘤干细胞特性，CXCR4 通过激活Akt 信号通路促进ESCC 殖与迁移，共同引导了ESCC 的转移。趋化因子CXC 亚家族12 是可使细胞定向移动的小分子分泌蛋白，CXCR4 是趋化因子CXC 亚家族12 的特异性受体，CXCR4 与趋化因子CXC 亚家族12 结合，可激活多种下游信号通路，包括Ras-MAPK、PI3K-AKT-mTOR及Jak2/3-STAT2/4 等，促进肿瘤的发生、发展[10]。基础实验提示CXCR4 与上皮-间充质转化之间在A549细胞株中具有内在关联，两者在生理功能上具有相似性[21]。上皮-间充质转化不仅使肿瘤细胞失去细胞间的粘连并增强其运动性和侵袭性，导致多种肿瘤进展，而且增加了肿瘤细胞对细胞凋亡和抗肿瘤治疗的抵抗力[22-23]。临床前研究表明，抑制CXCR4 表达与其他治疗方法联合使用，可以提高某些肿瘤的治疗效果，Domanska 等[24]报道了CXCR4 抑制剂AMD3100 可使前列腺癌细胞对多西他塞敏感，Chen 等[25]发现AMD-3100 与PD-1 抗体和索拉非尼联合治疗肝细胞癌时具有额外的抗肿瘤活性。

本研究以ESCC 组织中CXCR4 的表达水平为重点，探索了ESCC 与CXCR4 的表达相关的临床病理因素，通过生存分析探讨了CXCR4 的表达与ESCC患者预后的联系。通过对ESCC 组织中CXCR4 表达水平进行评估，本研究结果显示，在107 例ESCC 患者中，CXCR4 在癌组织中的表达率为56.1%，而癌旁组织中不表达，这与Yang 等[26]的报道一致，该研究报道的101 例ESCC 患者癌组织中CXCR4 表达率为37.6%，而在邻近组织中未见阳性表达。本研究对CXCR4 表达水平与ESCC 患者临床病理参数的相关性进行分析，结果显示年龄≥60 岁、肿瘤分化程度越低、侵犯越深、有淋巴结转移的情况下，CXCR4 阳性表达率越高，这一结果与既往研究类似。Yang 等[26]纳入101 例ESCC 患者，分析CXCR4 与临床病理因素的关系，发现CXCR4 阳性表达与肿瘤分化不良和淋巴结转移有关。Kaifi 等[27]研究发现，有淋巴结转移的ESCC患者，CXCR4 更倾向于表达。Koishi 等[28]提出，CXCR4持续阳性表达与放化疗后ESCC 的侵袭性和不良预后有关。结合本研究结果，可推测CXCR4 可能促进ESCC 对食管的侵袭和淋巴结转移。

本研究结果显示，CXCR4 阳性表达患者的OS 低于阴性患者，这一结果与Goto 等[29]的研究一致。本研究结果显示，CXCR4 阳性表达患者DFS 低于阴性患者。多因素Cox 回归分析结果显示，CXCR4 表达水平是ESCC 患者预后的独立影响因素，这些结果提示CXCR4 阳性表达不利于ESCC 患者的预后。

综上所述，ESCC 组织中CXCR4 阳性表达率升高，CXCR4 阳性表达可能促进肿瘤对食管的侵袭及淋巴结转移的发生。CXCR4 表达水平是ESCC 患者预后的重要影响因素。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。