miR-181a-5p在ACS患者血清中表达及对人HCASMC细胞增殖迁移的调控作用、与ADAMTS1靶向关系

2024-04-09 12:07颚璐莎易华张艳芳
山东医药 2024年6期
关键词:荧光素酶平滑肌硬化

颚璐莎,易华,张艳芳

1 内蒙古自治区人民医院心内科,呼和浩特 010017;2 内蒙古自治区人民医院病理科

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是世界范围内常见的心血管疾病,主要包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和不稳定心绞痛(unstable angina pectoris,UAP),冠状动脉粥样硬化是其病理学基础[1]。近年来ACS 发病率呈逐年增加的趋势,是造成冠心病患者病死率升高的主要病因[2]。目前ACS 患者冠状动脉粥样斑块及不稳定性状态的形成机制尚未完全明确,血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖、迁移及炎症反应可能是冠状动脉粥样斑块形成及影响斑块稳定性的主要因素[3]。最新研究[4-5]发现,微小RNA(microRNA,miRNA)在ACS 的发生发展中发挥着重要作用,参与调控动脉粥样硬化斑块的形成及稳定性。微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)属于miRNA 家族成员,其在细胞增殖、分化、迁移等多种生理病理过程中起着 极 其 重 要 的 作 用[6]。近 期 动 物 实 验[7]发 现,miR-181a-5p在动脉粥样硬化ApoE-/-模型小鼠动脉粥样硬化斑块和血浆中表达均明显降低,上调miR-181a-5p表达能够延缓动脉粥样硬化ApoE-/-模型小鼠粥样斑块的形成,增加斑块的稳定性。但目前miR-181a-5p在ACS中的研究甚少,并且其对冠状动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移的作用尚不明确。血小板反应蛋白解整合素金属肽酶1(ADAMTS1)是一种分泌性蛋白酶,已有研究发现其与动脉粥样硬化关系密切,与斑块的形成及不稳定性密切相关[8]。近期研究[9]发现,ADAMTS1的3'UTR区上有miR-181a-5p的潜在结合位点,ADAMTS1基因可能是miR-181a-5p的下游作用靶基因。但至今miR-181a-5p 在ACS 中作用的下游分子机制是否与其对ADAMTS1 基因的靶向作用有关尚不清楚。为此,我们观察了miR-181a-5p 在ACS 患者血清中表达及对人冠状动脉平滑肌细胞增殖、迁移调控作用,进一步探讨其与ADAMTS1的靶向关系,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人冠状动脉平滑肌细胞系HCASMC 购自美国Lifeline公司,采用DMEM 培养基常规传代培养,2~3 d 传代一次,取第4 代细胞进行后续实验。TRIzol 试剂购自北京天根公司;LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司;血清miRNA提取试剂盒购自美国Ambion 公司;miR-181a-5p 模拟物(miR-181a-5p mimics)、模拟物阴性对照(mimics-NC)、miR-181a-5p 抑制物(miR-181a-5p inhibitor)、抑 制物 阴 性对 照(inhibitor-NC)及 突变 型ADAMTS1 荧光素酶报告基因质(ADAMTS1-MUT)、野生型ADAMTS1 荧光素酶报告基因质粒(ADAMTS1-WT)均购自上海吉玛制药公司;qRT-PCR 相关引物购自广东锐博生物公司;CCK-8检测试剂盒购自武汉博士德公司;Transwell 小室购自美国Corning 公司;逆转录试剂盒、qRT-PCR 试剂盒购自日本TaKaRA 公司;双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega 公司;BCA 蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo 公司;兔抗人ADAMTS1 单克隆抗体购自美国CST公司。

1.2 ACS患者血清miR-181a-5p表达观察

1.2.1 临床资料 选择2021 年5 月—2023 年5 月在我院心内科住院治疗并行冠脉造影的100 例ACS患者,其中男62 例、女38 例,年龄(55.6 ± 6.8)岁。纳入标准:①符合美国心脏病学会/美国心脏协会(ACC/AHA)发布的心血管诊疗指南标准;②年龄>18 岁。排除标准:①近期接受过支架置入、冠状动脉溶栓或搭桥手术的患者;②合并有肝肾功能不全、自身免疫性疾病及恶性肿瘤等严重疾病;③合并有急慢性感染、急性脑卒中等;④患者均对本研究知情同意。100 例ACS 患者中AMI 患者55 例、UAP 患者45例。同期收集40例我院心内科行冠脉造影结果阴性者为对照组,其中男26 例、女14 例,年龄(54.9 ±7.7)岁,两组患者在年龄、性别等一般资料具有可比性,本研究经医院伦理委员会批准。

1.2.2 两组血清miR-181a-5p 检测 两组均于入院24 h 内采集空腹外周静脉血5 mL,离心分离血清,-80 ℃低温冰箱保存。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测两组血清miR-181a-5p,应用miRNA 提取试剂盒提取患者血清中的总RNA, 应用TRIzol 试剂提取HCASMC 细胞总RNA,应用逆转录试剂合成cDNA。以cDNA 为模板,进行qRT-PCR反应,以U6 作为内参基因。使用的引物序列如下:miR-181a-5p 引物序列:上游:5'-GCCGAACATTCAACGCTGTCG-3',下游:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR 反应条件:95 ℃ 20 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,70 ℃ 10 s,共40 个循环。以2-ΔΔCt代表miR-181a-5p的相对表达量,重复测算3次,取平均值。

1.3 miR-181a-5p 对HCASMC 细胞增殖、迁移的调控作用观察

1.3.1 HCASMC 细胞分组及miR-181a-5p 模拟物、miR-181a-5p 抑制物转染方法 取对数生长期HCASMC 细胞分为一、二、三、四组,采用脂质体转染法应用转染试剂LipofectamineTM2000 分别转染miR-181a-5p mimics、mimics-NC、miR-181a-5p inhibitor、inhibitor-NC,培养24 h 时采用qRT-PCR 法检测各组细胞miR-181a-5p。一、二、三、四组细胞miR-181a-5p相对表达量分别为6.30 ± 0.17、1.02 ± 0.04、0.46 ±0.12,与二组相比,一组细胞miR-181a-5p相对表达量高(P<0.05),与三组相比,四组细胞miR-181a-5p相对表达量低(P<0.05),说明转染成功。

1.3.2 各组细胞增殖情况观察 培养48 h 收集各组细胞,采用CCK-8 实验观察细胞增殖情况。取各组细胞,接种于96 孔细胞板,细胞密度为5 000/孔,每组6个平行孔,所有操作均严格参照CCK-8试剂盒说明书进行,避光条件下各孔分别加入10 μL 的CCK-8溶液,置入细胞培养箱内继续孵育4 h,在酶标仪上测定各孔波长450 nm 处的吸光度(OD)值。以OD值代表细胞的增殖能力,实验重复3次,取平均值。

1.3.3 各组细胞迁移情况观察 培养48 h 收集各组细胞,采用Transwell 迁移实验观察细胞迁移情况。取各组细胞,取Transwell小室置于无菌24孔板中,在Transwell 小室的上室加入0.1 mL 细胞悬液(含1×103个细胞),下室加入0.6 mL 含10 % 胎牛血清的DMEM 培养基,孵育24 h 后取出,棉签擦去基质和上室未迁移的细胞,多聚甲醛固定后染色,倒置显微镜下拍照,测管各组穿膜细胞数,以穿膜细胞数代表细胞的迁移能力,实验重复3次,取平均值。

1.3.4 各组细胞ADAMTS1 蛋白检测 培养24 h时取各组细胞,采用Western Blotting 法检测细胞ADAMTS1 蛋白。应用RIPA 细胞裂解液裂解细胞,BCA 法蛋白定量。取40 μg蛋白上样进行10% SDSPAGE,湿转至PVDF 膜上,5 %脱脂奶粉室温封闭1 h,而后加入一抗ADAMTS1(工作浓度1∶2 000)抗体和GAPDH(工作浓度1∶5 000)抗体,4 ℃反应过夜,次日再加入二抗(工作浓度1∶10 000),室温孵育2 h,发光剂曝光、显影。GAPDH 蛋白作为内参,以蛋白条带灰度值代表目的蛋白的相对表达量。实验重复测算3次,取平均值。

1.4 HCASMC 细胞中miR-181a-5p、ADAMTS1 的靶向关系观察 取对数生长期HCASMC 细胞接种于24 孔板,分为A、B、C、D 四组,每组6 个复孔,A 组应用LipofectamineTM2000 先后转染ADAMTS1-MUT、miR-181a-5p mimics ;B 组 先 后 转 染ADAMTS1-MUT、mimics-NC;C 组 先 后 转 染ADAMTS1-WT、miR-181a-5p mimics; D 组先后转染ADAMTS1-WT、mimics-NC,培养24 h 时取各组细胞,采用双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞的相对荧光素酶活性。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行,实验重复测算3次,取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。正态性分析采用Shapiro-Wilk 检验,符合正态分布的计量资料以±s表示,两组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验;计数资料以%表示,组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者血清miR-181a-5p 相对表达量比较 ACS组、对照组患者血清miR-181a-5p相对表达量分别为0.48 ± 0.04、1.01 ± 0.03,二者相比,P<0.05。UAP患者、AMI患者血清miR-181a-5p相对表达量分别为0.76 ± 0.05、0.25 ± 0.03,二者相比,P<0.05。

2.2 各组细胞增殖能力、迁移能力及ADAMTS1 蛋白相对表达量比较 培养48 h 时一、二、三、四组细胞 增 殖 能 力 分 别 为1.45 ± 0.12、2.15 ± 0.13、2.95 ± 0.20、2.10 ± 0.11,迁移能力分别为(18 ±5)、(45 ± 9)、(59 ± 8)、(38 ± 6)个。与二组相比,培养48 h时一组细胞增殖能力和迁移能力降低(P均<0.01);与四组相比,培养48 h 时三组细胞增殖能力和迁移能力高(P均<0.01)。培养24 h时一、二、三、四组细胞ADAMTS1 蛋白相对表达量分别为0.19 ±0.08、0.62 ± 0.13、0.92 ± 0.14、0.52 ± 0.12,与二组相比,一组细胞ADAMTS1 蛋白相对表达量低(P均<0.01);与四组相比,三组细胞ADAMTS1 蛋白相对表达量高(P均<0.01)。

2.3 各组细胞荧光素酶活性比较 A、B、C、D 组细胞荧光素酶活性分别为1.03 ± 0.03、1.01 ± 0.04、0.45 ± 0.06、1.02 ± 0.05。与B 组相比,A 组细胞荧光素酶活性明显低(P<0.05)。

3 讨论

动脉粥样硬化是冠心病、脑梗死和外周血管疾病的主要原因。动脉粥样硬化性心血管疾病仍然是全球人类死亡的主要原因,并且发病率呈逐年上升的趋势。冠状动脉粥样硬化是ACS 的病理学基础,冠状动脉粥样硬化是一种慢性疾病,其特征是对系统风险因素和局部促动脉粥样硬化刺激反应的不断进展。HCASMC 在动脉粥样硬化斑块的形成中起着至关重要的作用。内膜内血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移促进了冠状动脉粥样硬化斑块的形成,并且与晚期的脆弱斑块的稳定性有关。随着生物遗传学的发生发展,人们逐渐发现HCASMC 异常增殖和迁移与某些基因的异常表达有关。

miRNAs 是近年来新发现的小的非编码RNA 分子,约20~25 个核苷酸,通过靶向mRNA 的降解或阻断蛋白质翻译作为蛋白质表达的调节因子,参与机体细胞增殖、分化、凋亡、迁移等功能的调控。近年来研究[10-11]显示, miRNAs广泛参与动脉粥样硬化相关疾病发生发展机制的多个关键环节。李韶南等[12]发现血清中miR-21 水平与冠状动脉内斑块的不稳定状态密切相关。LAI 等[13]在研究中发现冠心病患者血清及冠状动脉平滑肌细胞中异常增高的miR-574 促进了冠状动脉平滑肌细胞的增殖并抑制其凋亡,促进动脉粥样硬化斑块的增长。近年来miR-135b、miR-499a 及miR-181b 等 多 个miRNA 被相继证实参与了冠状动脉粥样硬化的发生进展,并且与其对动脉平滑肌细胞的增殖、凋亡及迁移的调控有关[14-15]。miR-181a-5p 属于miR-181 家族重要成员,广泛参与造血系统、免疫系统、干细胞分化等调节,在肿瘤、炎症反应等方面起着重要的调节作用[6,16]。已有研究[17]显示冠心病和肥胖代谢综合症患者外周血中miR-181a-5p 表达显著降低,但其作用机制尚不清楚。本研究结果发现,ACS 组患者血清中miR-181a-5p 相对表达量较对照组明显降低,并且AMI 组患者血清中miR-181a-5p 相对表达量明显低于UAP 患者,提示miR-181a-5p 在ACS 发生发展中可能发挥着重要的作用,并且可能与粥样斑块稳定性有关。

血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移是动脉粥样硬化发生进展中的重要环节[18]。如何有效阻断血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移是目前动脉粥样硬化的研究热点问题。血管平滑肌细胞的增殖及迁移能够受到miRNAs的调控。CHEN等[19]发现miR-155-5p在ACS 患者血清中表达下降,miR-155-5p 能够抗动脉粥样硬化,其机制与其对血管平滑肌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用有关。相关研究[20]显示,miR-599 也能够参与对血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力的抑制,起到阻止动脉粥样硬化进展的作用。动物实验显示miR-181a-5p 与动脉粥样硬化斑块形成和稳定性密切相关,但具体作用机制尚不明确[7]。本研究通过脂质体转染法成功转染miR-181a-5p 模拟物、miR-181a-5p 抑制物至HCASMC 细胞,成功上调或下调细胞中miR-181a-5p 表达水平。进一步通过采用CCK-8 实验、Transwell 迁移实验发现,上调miR-181a-5p表达水平,能够明显抑制冠状动脉平滑肌细胞的增殖和迁移能力,而下调miR-181a-5p 表达水平能够明显促进冠状动脉平滑肌细胞的增殖和迁移能力,证实miR-181a-5p 表达与冠状动脉斑块的形成和稳定性有关,上调miR-181a-5p 表达能够起到抗动脉粥样硬化、稳定斑块的作用,可能成为ACS治疗的靶基因。

对下游靶基因转录调控,是miRNA 调控细胞功能的重要机制。miRNA 能够通过对下游一个或者多个靶基因的调控,通过不同的分子通路参与机体细胞功能的调控。既往研究显示ADAMTS1 基因可能是miR-181a-5p 的下游作用靶基因[9]。ADAMTS1是一种分泌性蛋白酶,属于ADAMTS 家族成员,能够通过参与细胞外基质的降解和重组,并且能够激活不同的细胞表面分子,在肿瘤、炎症和血管形成中起着发挥着重要的作用[21]。近年来越来越多的研究表明ADAMTS1与动脉粥样硬化关系密切,与斑块的形成及不稳定性密切相关[8]。研究[22]发现ACS 患者血清中ADAMTS1的表达水平显著升高,并且AMI患者随着心肌梗死面积的增加,患者血浆中ADAMTS1水平越高,并且发生心血管事件比例越高[23]。研究[24]已证实,动脉粥样硬化斑块中ADAMTS1 的表达明显增高,抑制血管平滑肌细胞中ADAMTS1 的表达能够明显抑制细胞的增殖及迁移能力[25]。本研究结果发现,miR-181a-5p 能够结合ADAMTS1 基因的3'UTR 从而使相对荧光素酶活性降低,上调miR-181a-5p 表达的HCASMC 细胞ADAMTS1 蛋白表达下降,而下调miR-181a-5p表达的HCASMC细胞ADAMTS1 蛋白表达升高,说明ADAMTS1 是miR-181a-5p的直接作用靶基因。

综述所述,ACS患者血清中miR-181a-5p在表达低,miR-181a-5p可抑制HCASMC细胞的增殖和迁移。miR-181a-5p 可通过靶向抑制HCASMC 细胞ADAMTS1蛋白表达,抑制HCASMC细胞的增殖和迁移。

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