成都地区拓扑异构酶基因突变在解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药中的作用

张红艳,郑良建,肖慈然,杨婷,丁少川,张剑波

解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,UU)也称为溶脲脲原体,隶属于细菌域、柔膜菌门、柔膜菌纲、支原体目、支原体科下的脲原体属,分为2个生物群,共14个血清型。解脲脲原体主要存在于人体的泌尿生殖道,在男性可导致非淋菌性尿道炎、前列腺炎、附睾炎、不育等［1-2］;在女性导致阴道炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕不育、早产、围产期感染、合并阴道加德纳菌感染等［3-5］;还可以导致新生儿脑室出血、早产儿视网膜病变等不良妊娠结局［6］。

氟喹诺酮类药物具有广谱抗菌活性、口服吸收好、在泌尿生殖道中极易达到抗菌浓度等优点,成为临床上治疗支原体感染的一线药物。然而,由于抗生素滥用、反复感染及迁延不愈等多种因素,解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的敏感性下降,出现耐药并日趋严重,给临床治疗带来极大的挑战,严重威胁人类的身体健康和生活质量。尽管目前已有研究报道解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药率和耐药机制,但不同地区的研究结果之间存在地域差异。因此,研究本地区解脲脲原体临床株的拓扑异构酶基因突变特点对于掌握本地区耐药株的流行病学资料、减少耐药株的产生、指导临床用药以及提高患者治愈率具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1菌株来源 四川省医学科学院·四川省人民医院东院区2021年9月—2022年2月分离的对氟喹诺酮类药物不同程度耐药的解脲脲原体临床菌株。男性患者取尿道分泌物,禁尿2 h以上用无菌细小棉拭子缓慢插入尿道2～4 cm处,捻转1周并停留30 s后取柱状上皮细胞;女性患者取宫颈分泌物,无菌棉拭子插入宫颈1～2 cm旋转360°后停留30 s取柱状上皮细胞。标本采集后立即送检。

1.2标准菌株 解脲脲原体标准菌株ATCC27815由众爱生河北生物科技有限公司惠赠。

1.3主要试剂 支原体肉汤基础(英国OXOID公司),A7固体培养基(广东江门凯琳贸易有限公司),最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)药敏板(温州康泰生物科技有限公司),支原体鉴定及药敏试剂盒(众爱生河北生物科技有限公司),DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司),PCR试剂(成都擎科生物科技有限公司)。

1.4支原体鉴定及药敏试验 支原体鉴定及药敏试剂盒购自众爱生河北生物科技有限公司,液体培养基由黄色变为粉红色且固体培养基上有典型的支原体菌落生长判读为阳性,低倍镜下观察解脲脲原体呈棕褐色“海胆”样菌落。具体操作及结果判定均严格按照试剂盒说明书进行。

1.516SrRNA分子鉴定 通过商品化试剂盒筛选出对氟喹诺酮类药物不同耐药表型的解脲脲原体共58株,其中有2株敏感株。将菌落在固体平板(A7琼脂)上纯化后, 按照天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA模板,并用16SrRNA测序技术对其进行分子鉴定。

1.6药物MIC值测定 经16SrRNA分子鉴定确认的阳性菌株,参照美国临床实验室标准化协会CLSI M43-A(2011版)指南［7］,将4种氟喹诺酮类药物环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、莫西沙星(MXF)和加替沙星(GAT)倍比稀释成12个不同的浓度,每次实验均设计2个空白,1个阴性对照和1个阳性对照。以解脲脲原体标准菌株ATCC27815为整个实验的对照组和质控株。采用微量肉汤稀释法测定MIC,LEV和MXF的MIC≥4 μg/mL判读为耐药。

1.7PCR扩增测序 针对UU拓扑异构酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的氟喹诺酮耐药决定区域(quinoloneresistancedeterminingregions, QRDRs)设计引物［8］。gyrA-F:TTGCTGCTTTCGAAAACGG,gyrA-R:CTGATGGTAAAACACTTGG;gyrB-F:CCTGGTAAAT TAGCTGACTG,gyrB-R:TTCGAATATGACTGCCATC;parC-F:ACGCAATGAGTGAATTAGG,parC-R: CACTATCATCAAAGTTTGGAC;parE-F:ATGGGCGGAA AATTAACGC,parE-R:CTTGGATGTGACTACCATCG。挑取A7固体培养基上的单颗菌落,按照天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明提取DNA模板。PCR扩增采用50 μL的反应体系,反应条件为:98 ℃预变性3 min; 98 ℃变性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s,共循环40次;最后72 ℃进一步延伸5 min。PCR反应完毕后,将产物点样于溴乙锭预染色的1.25%的琼脂糖凝胶上电泳35 min,同时用DL5000 DNA Marker做对照。目的条带回收纯化后,由成都擎科生物技术有限公司进行测序。

1.8数据分析 测序结果用DNAMAN软件和BLAST将测定序列与标准菌株ATCC27815(GenBank CP000942.1)的序列进行比对,找出拓扑异构酶基因的碱基突变位点及相应的氨基酸改变。分析gyrA、gyrB、parC、parE基因QRDR区域的基因突变与氟喹诺酮类药物MIC值的相关性。

2 结果

2.1解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药率 2021年9月—2022年2月本院区微生物实验室共收到支原体培养标本1 387例,其中解脲脲原体单独阳性感染的有635例,解脲脲原体阳性率为45.78%(635/1 387)。从解脲脲原体阳性的标本中随机选取58例经16SrRNA基因测序证实为解脲脲原体的菌株进行微量肉汤稀释法药敏试验。药敏结果显示,解脲脲原体对左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率分别为79.31%(46/58)和5.17%(3/58),结果见表1。

表1 解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药率

2.2解脲脲原体拓扑异构酶QRDR区碱基与对应的氨基酸变异 在58株拓扑异构酶基因测序的UU中,有46株发生了parC基因248位碱基C到T的突变,导致ParC 83位丝氨酸变异为亮氨酸(TCA→TTA),ParC S83L的变异率为79.31%(46/58); 9株发生了parC基因373位碱基A到G的突变,导致ParC 125位苏氨酸变异为丙氨酸(ACA→GCA),ParC T125A的变异率为15.52%(9/58); 3株发生了gyrB基因1 384位碱基C到T的突变,导致GyrB 462位脯氨酸变异为丝氨酸(CCA→TCA),GyrB P462S的变异率为5.17%(3/58)。具体结果见表2,图1。

The arrow indicates a mutation in the 248 base C of the parC gene to T, resulting in ParC S83L; The arrow indicates a mutation at base C of gyrB gene 1 384 to T, resulting in GyrB P462S

表2 解脲脲原体拓扑异构酶QRDR区碱基与对应的氨基酸变异

2.3解脲脲原体QRDR氨基酸变异与氟喹诺酮类药物MIC值的相关性 对环丙沙星和左氧氟沙星同时耐药的解脲脲原体株发生了ParC S83L的氨基酸变异,ParC S83L的氨基酸变异使解脲脲原体对环丙沙星的MIC值从4 μg/mL升高至8～32 μg/mL,对左氧氟沙星的MIC值从2 μg/mL升高至4～16 μg/mL。对莫西沙星和加替沙星同时耐药的解脲脲原体株发生了GyrB P462S的氨基酸变异,GyrB P462S的氨基酸变异使解脲脲原体对莫西沙星和加替沙星的MIC值从2 μg/mL升高至4～8 μg/mL。ParC S83L合并GyrB P462S氨基酸变异时,解脲脲原体对环丙沙星的MIC值则可进一步升高至64～128 μg/mL,对左氧氟沙星的MIC值可进一步升高至32 μg/mL。7株耐药株和2株敏感株中发现了ParC T125A的氨基酸变异,ParC T125A变异株相较于未产生该变异的菌株,其与4种氟喹诺酮类药物MIC值的变化相关性差。标准菌株ATCC27815无任何氨基酸变异发生,所有菌株均未发现gyrA基因和parE基因对应的氨基酸改变,见表3。

表3 解脲脲原体 QRDR氨基酸变异与氟喹诺酮类药物MIC值的相关性

3 讨论

泌尿生殖道支原体感染是临床上关注的热点问题。解脲脲原体感染占据支原体感染的首位,与泌尿生殖道炎症、不孕不育等疾病密切相关。目前,大多数医疗单位均采用单纯的液体培养法对支原体进行鉴定和药敏试验,容易受到细菌和真菌的污染导致假阳性。本研究通过引入固体培养法来确认支原体的菌落形态,并进一步利用16SrRNA基因序列分析技术对解脲脲原体进行分子水平的鉴定,显著提高了泌尿生殖道支原体感染诊断的准确性。本研究综合美国临床实验室标准化协会CLSI M43-A文件和生殖道支原体感染诊治专家共识,采用微量肉汤稀释法检测解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的敏感性。结果显示,解脲脲原体对环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星的MIC50分别为16、4、1、1 μg/mL,MIC90分别为32、8、2、2 μg/mL,说明新一代氟喹诺酮类药物莫西沙星和加替沙星较老一代环丙沙星和左氧氟沙星具有较强的抗解脲脲原体活性。本研究显示,解脲脲原体对左氧氟沙星的耐药率高达79.31%,这与中国杭州地区和上海地区的研究相一致［9-10］。而在突尼斯、法国等地区,解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药率则较低［11-12］。德国的研究发现,解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药率为7.1%［13］。不同国家和地区的解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药性报道不一致,可能与研究的人群构成不同、样本量不同、抗生素使用习惯以及各地区流行率差异和检测方法不同等因素有关。

氟喹诺酮类药物作用靶酶是Ⅱ型拓扑异构酶,包括DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ。氟喹诺酮类药物通过与拓扑异构酶形成复合物来阻断DNA的复制、转录等功能,进而抑制DNA的合成,发挥抑菌或杀菌作用。DNA旋转酶又称拓扑异构酶Ⅱ,由两个亚单位A和B以A2B2的形式组成四聚体,其中A亚单位由染色体基因gyrA编码,B亚单位由染色体基因gyrB编码。拓扑异构酶Ⅳ也是A2B2形式的四聚体, 其中A亚单位由染色体基因parC编码,B亚单位由染色体基因parE编码。拓扑异构酶基因(gyrA、gyrB、parC、parE)的突变会导致细菌或支原体对氟喹诺酮类药物的耐药,这些区域称为QRDRs［14-15］。解脲脲原体对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率逐年上升,其最重要的耐药机制是由DNA旋转酶基因 (gyrA、gyrB)与拓朴异构酶Ⅳ基因 (parC、parE)在QRDRs发生点突变导致。

在本次纳入研究的解脲脲原体中,有46株发生了parC基因248位碱基C到T的突变,导致ParC 83位丝氨酸变异为亮氨酸(TCA→TTA); 9株发生了parC基因373位碱基A到G的突变,导致ParC 125位苏氨酸变异为丙氨酸(ACA→GCA); 3株发生了gyrB基因1 384位碱基C到T的突变,导致GyrB 462位脯氨酸变异为丝氨酸(CCA→TCA)。结果显示ParC S83L为本地区最常见的变异,变异率为79.31%。因此,ParC S83L变异为成都地区解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制,与国内外的研究报道一致［8-9,16-17］。

ParC S83L的氨基酸变异导致解脲脲原体对环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值升高了2～16倍,GyrB P462S的氨基酸变异使解脲脲原体对莫西沙星和加替沙星的MIC值从2 μg/mL升高至4～8 μg/mL,因此,gyrB基因的突变使解脲脲原体对莫西沙星和加替沙星从敏感变成了耐药。有3个样本同时发生了parC和gyrB基因的双突变,这3个样本对环丙沙星和左氧氟沙星的MIC值进一步增加到64～128 μg/mL和32 μg/mL,提示当DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ均发生变化, 则耐药程度大于单个酶改变,表明解脲脲原体对氟喹诺酮类耐药性相关的多个基因突变对于耐药性的表型有累加效应。7株耐药株和2株敏感株中发现了ParC T125A的氨基酸变异,ParC T125A变异株相较于未产生该变异的菌株,其与4种氟喹诺酮类药物MIC值的变化相关性差,表明ParC T125A变异与解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药没有相关性,只是非耐药相关的种属特异的多态性表现。日本学者发现了1株GyrA D112H变异［8］,但并没有足够证据表明gyrA基因突变与解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药有关。重庆地区的报道发现了1个新突变ParE L408I［18］,但该突变也没有引起解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药,可能为无义突变。表明拓扑异构酶gyrA和parE基因即使存在突变,也有可能是无义突变,在解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药中作用不大。本次研究所有菌株均未发现gyrA和parE基因对应的氨基酸改变,提示gyrA和parE基因在本地区解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药机制中不占主要作用。

综上所述,拓扑异构酶基因parC248位碱基C突变为T导致的ParC S83L变异为解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制,parC和gyrB基因的双突变可导致耐药性的进一步增加。此外,在解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药株中并非全部都能检出突变基因,这说明除了拓扑异构酶基因介导的耐药外,还可能存在其他的耐药机制,例如过度表达外排泵以及生物膜的形成［19-20］等因素。因此,解脲脲原体对氟喹诺酮类药物的耐药机制有待进一步深入研究。