不同产地太白贝母中11 种核苷与碱基类成分分析及产地差异研究

梅春梅，陈富贵，赵雨薇，王丹，史长灿，邱鸿凯，周浓，李伟东（. 南京中医药大学药学院中药炮制重点实验室，江苏南京0046；. 重庆三峡学院生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程研究中心，重庆4040）

太白贝母为百合科贝母属植物太白贝母Fritillaria taipaiensisP. Y. Li 的干燥鳞茎，收载于2020 年版《中国药典》川贝母项下，是川产道地细贵药材之一，具有清热润肺，化痰止咳的功效[1-2]。近年来随着太白贝母市场需求的增加，野生资源日渐匮乏，难以满足市场需求[3]。重庆、陕西等地人工栽培规模逐渐增加，各产地的太白贝母存在质量参差不齐的现象[4-5]。

太白贝母中含有生物碱、核苷和碱基类、皂苷类、多糖等多种活性成分，核苷与碱基类成分为其主要的水溶性活性成分[6-7]。研究[8-11]表明，核苷和碱基类成分具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤等作用，与川贝母的生物活性具有关联性，可作为川贝母药材的质量评价指标之一[12-13]。因此，本研究首次针对重庆、陕西、四川、云南、湖北等5个省（市）10批太白贝母中11种核苷和碱基类成分建立高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）分析方法，并进行方法学验证，同时对不同产地样品中的11种核苷和碱基类成分进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）、偏最小二乘判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），探讨太白贝母不同产地间的差异，为太白贝母的良种选育、引种驯化、规范化种植及药材质量标准提升提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器LC-20A 型高效液相色谱仪（日本岛津集团有限公司）；SB-5200DTN 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MS204S 型万分之一、MS105 型十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；HDL-4 型离心机（江苏省金坛市鸿科科技有限公司）。

1.2 试剂胞嘧啶（Cytosine，批号：PS020207）、尿嘧啶（Uracil，批号：PS020117）、胞苷（Cytidine，批号：PS020733）、鸟嘌呤（Guanine，批号：PS020174）、尿苷（Uridine，批号：PS020658）、腺嘌呤（Adenine，批号：PS020156）、肌苷（Inosine，批号：PS010437）、鸟苷（Guanosine，批号：PS020497）、胸腺嘧啶核苷（Thymidine，批号：PS020196）、腺苷（Adenosine，批号：PS020496）、2'-脱氧腺苷（2'-Deoxyadenosine，批号：PS220704-01），成都普思生物科技股份有限公司；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 样品根据课题组的前期产地调查，确定具有代表性的太白贝母采样基地，采集3年生的栽培品。样品经重庆三峡学院生物与食品工程学院郭冬琴教授鉴定为百合科贝母属植物太白贝母Fritillaria taipaiensisP. Y. Li 的鳞茎。样品信息见表1。将太白贝母鳞茎洗净泥沙，晾干水分，置于恒温干燥箱45 ℃烘干至恒质量，粉碎后过3号筛，备用。

表1 不同产地太白贝母的样品信息Table 1 Sample information of Fritillaria taipaiensis from different regions

1.4 实验方法

1.4.1色谱条件 色谱柱：Venusil MP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～5 min，1%～2%A；5～12 min，2%～3%A；12～20 min， 3%～14%A；20～27 min，14%～15%A；27～35 min，15%～20%A）；流速：1.0 mL·min-1，检测波长：260 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

1.4.3供试品溶液的制备 精密称取样品粉末1.0 g，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加蒸馏水10 mL，混匀；室温下超声提取60 min（超声功率300 W，工作频率40 kHz），取出，放至室温，摇匀；倒入离心管中，4 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），过滤；滤渣重复操作1次，合并滤液，以蒸馏水定容至20 mL量瓶中，用0. 22 μm微孔滤膜过滤，即得。

1.4.4方法学考察 线性关系考察：分别精密移取“1.4.2”项下对照品储备液适量，用水稀释成不同浓度的混合对照品溶液。按照“1.4.1”项下色谱条件进行测定，以各成分峰面积（Y）与其对应的浓度（X）进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限。

精密度试验：取同一对照品混合溶液，按照“1.4.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录各成分峰面积，计算RSD以考察仪器的精密度。

重复性试验：取太白贝母样品（S9）1.0 g，平行6 份，按照“1.4.3”项下方法制备成供试品溶液，按照“1.4.1”项下方法测定，记录各成分峰面积，计算RSD以考察方法的重复性。

稳定性试验：取太白贝母样品（S9）1.0 g，按照“1.4.3”项下方法制备成供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24 h 进样，记录各成分峰面积，计算RSD以考察样品稳定性。

加样回收试验：精密称取同一批已知含量的药材0.5 g（S9），平行6份，分别精密加入适量的对照品溶液，按照“1.4.3”项下方法制备成供试品溶液，测定样品含量，计算回收率，验证方法的准确性。

1.4.5样品含量测定 取10 批不同产地太白贝母样品1.0 g，各平行5 份，按照“1.4.3”项下方法制备成供试品溶液，测定11种核苷与碱基类成分的含量。

在这种供电方式下，信号源支持交流输入，通过小容量UPS为信号源供电。 在市电停电情况下，UPS所带蓄电池为信号源供电。如图2所示。

1.5 数据分析采用SPSS 26.0 软件，用Duncan 法（One-way ANOVA）多重比较各组样本差异显著性，以Simca 14.1 软件对各批次含量进行主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA），用Origin 2022 软件对特征性成分的含量进行绘图。

2 结果与分析

2.1 HPLC 测定结果太白贝母样品（S9）及11 种混合对照品的HPLC 色谱图见图1。结果显示，在“1.4.1”项下色谱条件下，样品在35 min 内可被全部洗脱，11 种核苷和碱基类成分能有效分离，且峰形良好，杂质干扰少。

注：A. 太白贝母样品（S9）；B. 混合对照品。1. 胞嘧啶；2. 尿嘧啶；3. 胞苷；4. 鸟嘌呤；5. 尿苷；6. 腺嘌呤；7. 肌苷；8. 鸟苷；9. 胸腺嘧啶核苷；10. 腺苷；11. 2'-脱氧腺苷图1 太白贝母样品和混合对照品的高效液相色谱图Figure 1 High performance liquid chromatograms of Fritillaria taipaiensis sample and mixed reference substance

2.2 方法学考察结果

2.2.1线性关系考察结果 11 种核苷和碱基成分标准曲线的回归方程见表2。相关系数均大于0.999 5，说明胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷、腺苷、2'-脱氧腺苷分别在0.775～15.504、0.922～18.432、0.432～0.860、0.204～4.080、 0.680～13.600、 0.482～9.648、 0.756～15.120、0.720～14.400、0.454～9.072、1.100～22.000、0.394～3.936 μg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。

表2 各成分回归方程、线性范围、检测限及定量限Table 2 Regression equation，linear range，limit of detection and limit of quantification for each component

2.2.2精密度考察 结果显示，胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷、腺苷、2'-脱氧腺苷峰面积的RSD 分别为0.65%、 0.44%、 0.61%、 1.03%、 0.37%、 1.30%、0.49%、0.67%、0.68%、0.53%、1.26%，表明仪器精密度良好。

2.2.3重复性考察 结果显示，太白贝母样品（S9）中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷、腺苷、2'-脱氧腺苷峰面积的RSD 分别为2.23%、1.27%、2.18%、1.24%、2.33%、 2.01%、 1.49%、 1.88%、 1.18%、 1.08%、2.45%，表明该方法的重复性良好。

2.2.4稳定性考察 结果显示，太白贝母样品（S9）中胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷、腺苷、2'-脱氧腺苷不同时间点测得的峰面积RSD分别为1.04%、2.45%、1.81%、1.18%、 2.62%、 1.67%、 2.37%、 1.14%、 1.88%、2.46%、2.38%，表明样品供试液在24 h内稳定。

2.2.5加样回收率考察 太白贝母样品（S9）中11个核苷和碱基类成分的平均回收率结果在96.10%～103.43%范围内，RSD 在1.27%～2.84%之间，均符合分析要求，表明该方法准确度较好。见表3。

表3 太白贝母11 种核苷与碱基类成分加样回收率结果（n=6）Table 3 Recovery results of 11 nucleosides and base components of Fritillaria taipaiensis（n=6）

（续表3）

2.3 样品含量测定结果由表4 可知，重庆市奉节县（S2）、巫山县（S3）、巫溪县（S9、S10）、湖北省恩施州（S8）样品的11个成分核苷和碱基总含量比其他产地样品高。重庆巫溪（S1）样品中未检测到胞嘧啶，陕西太白（S6）和四川广元（S7）2个产地样品中未检测到胞嘧啶和2'-脱氧腺苷。各个产地样品中尿苷、鸟苷和腺苷等成分的含量整体较高，腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷和2'-脱氧腺苷等成分的含量整体偏低。单因素方差分析的结果表明，各成分在各产地样品间存在一定的差异。

表4 不同产地太白贝母样品11 种核苷与碱基类成分含量测定结果（μg·g-1，±s，n=5）Table 4 Content determination of 11 nucleosides and base components in Fritillaria taipaiensis from different origins（μg·g-1，±s，n=5）

表4 不同产地太白贝母样品11 种核苷与碱基类成分含量测定结果（μg·g-1，±s，n=5）Table 4 Content determination of 11 nucleosides and base components in Fritillaria taipaiensis from different origins（μg·g-1，±s，n=5）

注：“-”表示未检测到；同一行中字母均不同表示差异有统计学意义（P＜0.05），如“a”与“b”，“cd”与“ef”

成分胞嘧啶尿嘧啶胞苷鸟嘌呤尿苷腺嘌呤肌苷鸟苷胸腺嘧啶核苷腺苷2'-脱氧腺苷各成分总量样品S1-42.23±2.34cd 72.71±12.19d 36.99±1.18b 290.28±27.88c 25.10±0.51d 18.32±1.29b 183.04±15.35ab 36.44±3.87c 218.85±4.16e 18.23±1.61c 942.19±4.22a S2 72.87±1.19c 195.38±18.20f 47.37±2.00b 74.23±6.65d 169.65±22.12a 20.51±0.28c 198.53±13.33h 251.04±19.72e 9.54±0.90a 132.28±4.41a 7.74±0.00a 1179.15±3.64 S3 65.49±5.01b 51.00±1.16d 47.86±7.19b 32.94±3.00ab 333.35±6.15d 26.45±0.88de 31.54±3.83c 210.90±3.95cd 49.59±3.01d 271.22±3.41f 41.09±3.44fde1161.44±2.18cd S4 83.17±1.99d 44.39±3.74cd 37.04±1.70a 37.69±2.54b 295.47±4.86c 27.91±1.23e 45.97±2.50d 181.05±2.11a 29.42±0.29b 209.01±2.47d 14.31±0.35b 1005.42±0.30b S5 55.71±2.68a 28.56±5.77a 31.22±2.43a 26.33±2.39a 291.75±8.81c 20.57±0.51c 8.89±2.79a 191.16±7.94ab 37.24±3.39c 275.07±7.27f 26.25±0.92d 992.75±1.65b S6-87.77±2.30e 58.18±6.30c 55.86±2.17c 267.38±10.62b 30.00±0.57f 68.79±2.13f 197.80±13.01bc 38.62±3.81c 208.53±5.34d-1012.93±0.97b S7-32.68±1.91ab 44.84±2.67b 55.48±19.38c 171.40±13.66a 35.85±2.90g 145.75±5.71g 215.65±7.91d 27.84±1.13b 201.26±1.45c-930.75±2.64a S8 111.22±11.93e 37.78±1.34bc 51.25±5.15bc 50.83±4.03c 337.82±13.40de 13.93±1.39b 15.62±0.88b 225.99±4.50d 60.78±5.67e 285.37±8.74g 50.79±2.03g 1241.37±1.91f S9 71.36±2.40c 27.95±0.96a 52.63±4.25bc 49.52±2.08c 346.82±13.19de 14.60±1.24b 31.24±1.72c 191.20±5.70ab 27.59±1.85b 300.72±1.15h 17.70±0.26c 1131.33±1.50c S10 108.28±4.70e 48.74±4.39d 66.81±2.75d 92.94±4.86e 357.29±17.76e 5.53±0.23a 54.59±4.16e 190.76±16.68ab 67.31±4.33f 191.51±3.01b 33.30±0.97e 1217.07±3.17ef

2.4 化学计量学分析结果

2.4.1主成分分析（PCA） 对不同产地太白贝母核苷与碱基类成分进行KMO 检验和Bartlett 球形检验。结果KMO 值为0.615，大于0.5；Bartlett 球形检验显著性小于0.001，说明原始变量适合进行因子分析[14]。将各成分的含量测定结果进行PCA。结果见表5。以特征值＞1 为提取标准，提取3 个主成分因子，累积方差贡献率达到82.00%，可以用这3 个主成分反映不同产地太白贝母样品的原始信息。由表6可知，主成分1 反映尿嘧啶、肌苷、鸟苷、尿苷、腺苷的信息，主成分2 反映胞嘧啶、胸腺嘧啶核苷、2'-脱氧腺苷、腺嘌呤的信息，主成分3反映胞苷和鸟嘌呤的信息。

表5 太白贝母11 种核苷与碱基类成分主成分特征值及方差贡献率Table 5 Principal component eigenvalues and variance contribution rate of 11 nucleosides and bases of Fritillaria taipaiensis

表6 太白贝母11 种核苷与碱基类成分旋转后的成分矩阵Table 6 The rotated component matrix of 11 nucleosides and base analogs in Fritillaria taibaiensis

由PCA 得分图（见图2-A）可知，不同产地样品间差异明显，尤其是重庆市奉节县（S2）、陕西省太白县（S6）、四川省广元市（S7）与其他产地样品差异较大，重庆市巫溪县（S1、S9）、城口县（S4）、巫山县（S3）和云南省丽江市（S5）等5 个产地样品差异较小。PCA 结果表明，湖北恩施（S8）、重庆巫溪（S10）2 个产地聚为一类；重庆奉节（S2）单独为一类；陕西太白（S6）、四川广元（S7）可聚为一类，其余样品可聚为一类。载荷图表示每个变量对样品分布贡献的大小，每个点代表一个变量，距离荷载图原点越远的变量，权重越大，代表该成分对样品整体所起作用越大[15]。由载荷图（图2-B）可知，尿嘧啶、肌苷、胞嘧啶、尿苷、腺苷对产地区分的贡献最大。

图2 不同产地太白贝母核苷与碱基类成分的PCA 得分图（A）和载荷图（B）Figure 2 PCA score（A）and load diagram（B）of nucleoside and base components of Fritillaria taibaiensis from different origins

2.4.2层次聚类分析 见图3。将不同产地太白贝母核苷与碱基类成分的含量进行层次聚类分析（HCA），结果表明以欧式距离10 为界，可聚为4 类，分别为：湖北恩施（S8）、重庆巫溪（S10）2 个产地聚为一类，重庆奉节（S2）单独为一类，重庆巫溪（S1）、四川广元（S7）、陕西太白（S6）3 个产地聚为一类，其他产地聚为一类。与PCA 结果对照，除重庆巫溪（S1）样品外，本结果与PCA结果一致。

图3 不同产地太白贝母层次聚类分析图Figure 3 Hierarchical cluster analysis of Fritillaria taibaiensis in different origins

2.4.3偏最小二乘判别分析 根据PCA 和HCA 的结果，各组间分别进行PLS-DA 分析，结果显示，模型分类变量解释度指标为0.85；模型预测有效性指标Q2为0.808，两个参数越接近1 模型越可靠。将模型进行200次置换检验，如图4-A 所示，Q2回归线截距小于0，且左侧随机排列得到的R2和Q2均小于右侧原始值，表明所构建的PLS-DA 模型未出现过拟合现象，有较好的预测能力，可用于进一步数据分析。根据模型中变量投影重要性（variabl importance in the projection，VIP）值，筛选不同产地样品的差异成分。结果见图4-B。尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷、腺苷的VIP 值大于1，对样品分组贡献最大。说明这5 个成分对太白贝母产地区分起到最重要的作用，可初步筛选为区分太白贝母不同产地的潜在指标性成分。

图4 11 种核苷与碱基类成分的载荷图（A）和变量投影重要性（VIP）值图（B）Figure 4 Loading diagram（A）and variable importance in projection（VIP）value diagram of 11 nucleosides and base components（B）

2.4.4不同产地样品指标性核苷与碱基类成分含量分析 根据PCA及PLS-DA结果可知，尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷和腺苷5种成分可作为区分不同产地样品的指标性成分。其含量结果如图5所示，重庆市奉节县（S2）、巫山县（S3）、巫溪县（S9、S10）、湖北省恩施州（S8）样品中5 种成分总量比其他产地样品高，与表4 中各样品11 种成分的总量趋势一致。说明所筛选出的5种指标性成分可作为不同产地太白贝母的质控指标。

图5 不同产地太白贝母的5 种指标性核苷及碱基类成分含量Figure 5 The contents of 5 index nucleosides and base components of Fritillaria taippensis from different origins

3 讨论

太白贝母主要分布在秦巴山区，在重庆巫溪、城口等地作为“川贝母”习用种植时间己久[4-5]，自20世纪80 年代成功野生变家种[16]，现主要种植在重庆、陕西、四川、云南等地。其药用历史悠久，是一种应用广泛的化痰类药食同源中药材。本研究采用HPLC-DAD 法分别测定不同产地太白贝母的水溶性成分（胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶核苷、腺苷、2'-脱氧腺苷）的含量。核苷和碱基类为水溶性成分，易溶于水、甲醇和乙醇。本研究考察了流动相（甲醇-水、甲醇-0.01%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸）、流速（0.8、0.9、1.0 mL·min-1）、柱温（28、30、32 ℃）、进样量（5、10、15、20 μL）、吸收波长（220、260、280 nm），最终确定流动相为甲醇-水的线性梯度洗脱，柱温：30 ℃，检测波长：260 nm。结果表明具有良好的线性关系、精密度、稳定性、重复性和加样回收率，分离效果、待测成分峰形较好，可为其水溶性成分的研究及其质量控制提供有效的方法。

药用植物的品质与产地环境具有一定的相关性[17]。前期研究[7，12-13]表明，不同产地太白贝母的品质存在一定差异性，但样品代表性尚不明确。为此，本研究所选样品的采集时间、年限（根据鳞茎性状判断）及样品前处理等条件基本一致，而且为某一分布区的混合样品，能反映该区域太白贝母产地样品的整体状况，这与王骞等[18]采用的方法一致，保证了样品来源和结论可靠性。结果显示，不同产地的太白贝母中11种核苷和碱基类成分的含量存在一定差异，重庆市奉节县（S2）、巫山县（S3）、巫溪县（S9、S10）、湖北省恩施州（S8）产地样品中11 个成分核苷和碱基总含量比其他产地样品高。PCA 提取得到特征值＞1 的3 个主成分，累积贡献率达到82.00%，可以反映原始数据的大部分信息；HCA 表明，不同产地可聚为4类，其中湖北恩施和重庆巫溪的样品聚为一类，可以与其他产地样品区分。基于PCA 和HCA的分析结果，对不同产地太白贝母进行PLS-DA 分析，确定尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷和腺苷5种核苷和碱基类成分为指标性成分。以这5种指标性成分为评价指标，结果表明重庆市奉节县、巫溪县、巫山县和湖北省恩施州样品中含量最高，可以相互佐证本实验结果的准确性。从本实验研究看出，同一气候条件下样品S1、S9、S10（巫溪县），不同产地环境种植的太白贝母药材的核苷和碱基类成分含量也存在差异，这与张海娟[19]、张富丽[20]等分别对暗紫贝母、贝母属药材的研究结果一致，引起差异的原因可能与种质资源、栽培条件等有关，有待进一步研究。

综上所述，重庆、湖北产的太白贝母中的核苷与碱基类成分含量总体高于云南、四川、陕西产的样品，其中重庆市奉节县、巫山县、巫溪县和湖北恩施产的样品含量较高，这也体现了重庆太白贝母的道地优势，可为科研和生产过程太白贝母采购的产地选择及优良新品种选育提供参考。