基于条件优化探索对流免疫电泳技术的实验教学设计

康艳华，姚佳露，杜斌豪

（杭州师范大学 基础医学院，浙江 杭州 310000）

对流免疫电泳（convective immunoelectrophoresis，CIEP）是一种结合了双向琼脂扩散和电泳的定向加速免疫扩散技术。该技术具有微量、快速和高灵敏性等特点，可用于抗原或抗体的快速诊断。在高校免疫学实验教学中，CIEP是最经典的教学项目之一［1］。其实验原理是在pH8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原带有强负电荷，在电场中向正极移动；而IgG类抗体带有较少的负电荷且分子量较大，因此它们本身移动缓慢甚至不移动，但在电泳介质的电渗作用下向负极移动。抗原抗体在比例适当处形成沉淀线，并可以通过沉淀线相对于两孔位置来判断它们之间的比例关系［2］。目前，CIEP已被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫和毒素等抗原或抗体的定性分析、效价测定及分类鉴定［3-5］。

近年来，对流免疫电泳常用的巴比妥电泳缓冲系统的试剂不易购得，而其他替代缓冲液的使用效果存在争议［6］。因此，在实验原理和电泳缓冲系统特性的基础上，我们进行了三种Tris缓冲液与巴比妥电泳缓冲液的使用效果比较，并分析了电泳介质、电泳时间对实验结果的影响，以期寻求最佳实验方案并推广应用。

一、材料与方法

（一）实验动物

成年家兔（体重约2.5 kg），由杭州师范大学实验动物中心提供。

（二）主要试剂

牛血清白蛋白（BSA，A116563，阿拉丁）、纯琼脂粉（凝胶强度＞1 300 g/cm2，Biosharp）三羟甲基氨基甲烷（B010038，安耐吉）、琼脂糖（A104062，阿拉丁）、50×TAE缓冲液（T197243，阿拉丁）、5×TBE缓冲液（T196389，阿拉丁）、完全弗氏佐剂（F5881，Sigma）、不完全弗氏佐剂（F5506，Sigma），均购自国药集团化学试剂有限公司。

（三）设备与仪器

DYCP-38C型卧式水平电泳仪（北京六一仪器厂）、恒温恒湿培养箱（BSC-150，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、离心机（ST-16R，Thermo Fisher）、载玻片、打孔样纸、打孔、针头、湿盒等。

（四）实验方法

1.抗血清制备。6只新西兰大白兔适应饲养1周后。按照参考文献［7］报道的免疫程序，稍加改进进行免疫。将抗原与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化后进行皮内、皮下首次免疫家兔，于免疫后第7、14天以同样剂量与方式进行第二次和第三次免疫，首免后第21天，不加佐剂经耳缘静脉进行加强免疫，共免疫4次。末次免疫一周后经颈动脉采血，置37 ℃恒温培养箱孵育2小时；2 500转/分离心5分钟；收集上清液，即为兔抗血清，分装后置-80 ℃保存备用。

表1 缓冲液的配制

2.缓冲液的配制。

3.双向琼脂扩散试验。参照文献［8］报道的方法，在琼脂玻片上制备梅花型孔，将20μL抗原（5 mg/mL BSA）加入中央孔，按顺时针方向分别加入免疫血清原液，分别按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的比例稀释的免疫血清加入周围孔中。37 ℃下孵育24小时后观察结果，并以出现清晰的白色沉淀线的最高稀释度作为抗血清效价。

二、实验结果

（一）双向琼脂扩散试验测定抗血清效价

将抗血清按照不同的稀释比例进行双向琼脂扩散试验。结果如图1所示，当抗血清稀释比例为1∶4时，两孔之间可见清晰沉淀线，故免疫所获得兔抗BSA抗血清效价为1∶4。此浓度作为以下对流免疫电泳实验的抗血清浓度。

图1 双向琼脂电泳扩散试验结果

（二）对流免疫电泳实验条件的优化

1.不同的载体介质对免疫沉淀线形成的影响。琼脂和琼脂糖作为电泳介质广泛应用于DNA、免疫球蛋白、脂蛋白等大分子的分离与鉴定［9-11］。本实验比较了两者作为电泳支持介质对CIEP实验结果的影响，结果显示，在pH8.6巴比妥电泳缓冲系统中，100 V电压，经过15～20 分钟电泳后，在1.2%琼脂凝胶板上两孔之间可见较淡的白色沉淀线；而在琼脂糖凝胶板上则不明显（如图2）。由此可见，琼脂作为对流免疫电泳支持介质效果更佳。

图2 不同电泳介质对沉淀线形成的影响

2.不同电泳缓冲系统对免疫沉淀线形成的影响。在电泳实验中，电泳缓冲系统扮演着至关重要的角色。我们比较了科研领域常用的四种电泳缓冲系统在抗原-抗体对流免疫电泳实验效果上的差异。结果表明，在1.2%琼脂凝胶电泳15～20分钟后，四种不同的电泳缓冲系统均呈现清晰可见的白色沉淀线（如图3）。从沉淀线的形状和清晰度来看，TAE缓冲液与巴比妥缓冲液具有相当的缓冲性能。

图3 不同电泳缓冲系统对沉淀线形成的影响

3.不同浓度的琼脂凝胶对沉淀线形成的影响。经过观察不同浓度琼脂凝胶中的沉淀线形成，发现在巴比妥缓冲体系下，0.8%至1.5%范围内可见清晰可辨的沉淀线；而在TAE和TBE缓冲条件下，0.6%至1.5%范围内均呈现短粗且明显的沉淀线；Tris-HCl缓冲液需要将琼脂凝胶浓度控制在1.0%至1.5%，才能看到细长而清晰的沉淀线（如图4）。考虑到胶配制和打孔方便性的因素，建议使用1.0%～1.5%浓度的琼脂凝胶。

图4 不同浓度的琼脂凝胶对沉淀线形成的影响

三、讨论

经典的抗原抗体血清学检测技术——对流免疫电泳，是医学与生命科学相关专业本科生必备的免疫学实验内容。在本研究中，我们以自制备的兔抗BSA免疫血清为实验材料，并对CIEP实验条件进行了探索和优化，明确了适合该实验的电泳缓冲液、介质等关键因素，为实验教学提供理论支持和指导。

制备高效价的免疫血清是实验成败的关键。在本实验中，我们采用短程免疫法获得了满足实验教学要求所需的兔抗BSA血清，并比较分析了影响免疫电泳的因素，如电泳支持介质和缓冲体系。近年来，对流免疫电泳替代缓冲液的使用效果存在争议。周瑞雪等人［13］的研究表明，Tris-HCl缓冲液在替代巴比妥钠缓冲液方面具有最佳效果，其次是TAE。在我们的实验中，根据沉淀线形成的时间、形状及位置判断也验证了Tris-HCl缓冲液的效果。然而，与之不同的是，我们发现TAE的缓冲效果优于Tris-HCl，并且当琼脂凝胶浓度在1.0%～1.5%范围内时，能够形成清晰可见的细长型沉淀线。这一结果与张淑莉等［12］所得到的结论相符。尽管Tris-HCl和TAE作为缓冲液均易获取且成本较低，实验效果良好，但就安全性而言，Tris-HCl缓冲液在实验过程中可能会电解生成有毒气体氯气，对实验环境及实验者存在一定的危害性，而TAE缓冲液安全性较高，电泳过程中没有毒气的生成，并且实验效果较好，完全能够替代巴比妥缓冲液在对流免疫电泳中的使用［12］。

同时，我们发现TBE也可作为替代缓冲液。相较于TAE，TBE缓冲液具有更强的缓冲能力和电导率。然而，当琼脂凝胶浓度在0.6%～1.0%范围内时才能形成清晰、短粗的白色沉淀线。但在低浓度的琼脂凝胶板上制备上样孔比较困难，因此，若选择TBE作为电泳缓冲液，则最好配置1.0%琼脂凝胶浓度。

琼脂和琼脂糖是电泳实验中常用的支持介质，然而它们在对流免疫电泳实验中的应用仍存在争议。周瑞雪等［13］的研究表明，琼脂糖作为电泳介质对沉淀线形成具有最佳效果。这主要归因于其具有良好的电渗效应、高韧性和硬度以及便于打孔。然而，我们的实验结果与张淑莉等［12］的研究结果均表明，琼脂凝胶作为电泳支持介质更加优越。这可能是由于其含有硫酸根所致的高电渗力所致。相比之下，琼脂糖则是一种中性物质，由半乳糖及其衍生物构成，并不带任何电荷，因此它的电渗力相对较弱。同时发现，相同的电泳缓冲液下，沉淀线形成不仅与电泳支持介质有关，还受电泳时间的影响。在四种缓冲液的琼脂凝胶中，沉淀线能够在电泳15～20分钟内清晰可见，而在琼脂糖凝胶中，仅有TAE缓冲条件下，需要经过45～60分钟后才呈现沉淀线。此外，抗原-抗体在凝胶内形成沉淀线时，琼脂凝胶浓度也会影响到沉淀线的形状。为了方便进行打孔操作，建议将琼脂凝胶浓度控制在1.0%～1.2%。

综上所述，三种Tris缓冲液（TAE、Tris-HCl和TBE）均可替代巴比妥缓冲液用于对流免疫电泳实验，其中TAE效果最佳。此外，在选择电泳支持介质时，最佳选择为优质琼脂粉，其使用浓度应为1.0%～1.2%，电泳时间应控制在15～20分钟。