CRISPR-Cas系统在病原微生物分子诊断中的研究进展

龙文巧,许永杰 综述,张 华,△ 审校

1.遵义医科大学,贵州遵义 563000;2.贵州省人民医院检验科,贵州贵阳 550000

常见的病原微生物如病毒、细菌、真菌等引起的感染性疾病仍是危害人类健康的主要原因之一[1]。因此,快速、灵敏、准确、简便的检测方法对感染性疾病的诊断、疗效评估及预防控制具有重要意义。基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)系统的检测技术因具有高灵敏度、高特异度、快速、便携等优点而广泛应用于病原微生物的检测中[2]。

1987年ISHINO等[3]在大肠杆菌中首次发现了CRISPR基因组,2005年HAFT 等[4]鉴定了Cas的功能,随后POURCEL等[5]证明了CRISPR-Cas系统是细菌抵抗噬菌体入侵的适应性免疫系统。目前CRISPR-Cas系统除了应用于基因编辑技术外,还广泛应用于病原微生物核酸检测技术[6]。基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术表现出高灵敏度、高特异度、快速等优点,可实现现场检测,在感染性疾病诊断方面具有巨大应用前景。同时,基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术的进一步应用也存在许多挑战,这些挑战包括开发快速高效的核酸提取方式、简便的检测程序及高通量检测技术等[7]。随着基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术的发展,非核酸分析物的检测也成为当前研究热点[8]。本文概述了CRISPR-Cas系统的作用机制和不同效应蛋白的核酸酶活性,综述了CRISPR-Cas系统在病原微生物核酸检测中的应用研究进展和挑战,并进一步介绍了CRISPR-Cas系统在抗原、血清学抗体、病原体等非核酸分析物检测方面的最新研究热点。

1 CRISPR-Cas系统概述

CRISPR-Cas系统由存储记忆的CRISPR和Cas基因组成,这两部分共同作用形成CRISPR-Cas效应复合体,参与核酸识别、切割过程[4]。CRISPR-Cas系统通过将外来噬菌体DNA储存到细菌宿主染色体中形成记忆,进而阻止噬菌体再次感染。CRISPR-Cas系统遵循免疫的3个主要阶段[9]:(1)适应。对外来核苷酸序列识别、处理后将间隔序列整合到CRISPR基因座中,由此存储首次感染的记忆。(2)CRISPR RNA(crRNA)成熟。间隔序列翻译成crRNA和反式激活RNA通过碱基配对形成向导RNA(sgRNA),用于募集Cas。(3)干扰。Cas通过结合sgRNA形成效应复合物,在原间隔相邻基序(PAM)的协助下对靶标识别并切割,完成对外来核苷酸序列的特异性清除。

不同的Cas具有不同的核酸内切酶活性,当前研究主要集中于Cas9、Cas12、Cas13、Cas14,Cas9结合sgRNA后特异性识别和切割靶标,通过对切割产物的分析实现靶标的检测[10]。而Cas12、Cas13、Cas14识别并结合crRNA及靶标后形成效应复合体,该复合体可非特异性切割任意单链DNA或单链RNA,该过程被称为反式切割。此类蛋白反式切割大量带有标记的单链DNA或单链RNA报告探针,进而输出检测信号。基于CRISPR-Cas系统的病原微生物检测技术可分为两类[11]:第1类是通过提取基因组,联合CRISPR-Cas系统建立核酸检测方法;第2类是通过适配体或抗体识别非核酸分析物,直接或间接与CRISPR-Cas系统联合,实现非核酸分析物的检测。

2 基于CRISPR-Cas系统的病原微生物核酸检测

基于CRISPR-Cas系统的核酸检测技术常通过对样品中的微量核酸进行特异性识别和信号放大完成相关检测。目前,基于CRISPR-Cas9/Cas13/Cas12/Cas14系统的检测技术具有高特异度、高灵敏度、快速等特点,已被广泛应用于核酸检测中。基于CRISPR-Cas9系统的检测技术依赖于该系统识别及切割双链DNA(dsDNA)的能力,用于病原微生物的核酸检测。PARDEE等[12]将基于CRISPR-Cas9及含有激发序列的toehold传感器联合依赖核酸序列的扩增(NASBA)方法开发一种显色纸片检测技术,建立了可视化检测寨卡病毒检测技术,该技术通过比色法输出检测信号,检测灵敏度可达3 fmol/L,能鉴别美洲和非洲寨卡病毒株,且不需要昂贵的设备。但NASBA需要3种酶使得反应成本较高,反应成分较复杂,检测时间较长。选择合适的核酸扩增方法对提高检测平台的综合检测性能至关重要。此外,去核酸酶活性的Cas9(dCas9)保留了dsDNA的结合能力,对目标核酸序列无切割活性,也可用于核酸检测。HAIJIAN等[13]开发了CRISPR芯片(CRISPR-Chip)技术,该技术将dCas固定于石墨烯电子晶体管,在sgRNA辅助下,加入目标dsDNA后在晶体管上形成dCas-sgRNA-dsDNA复合物,该复合物会改变晶体管电导率,可根据电导率变化得出检测结果。CRISPR-Chip技术无须对靶标进行检测前扩增,可直接检测到1.7 fmol/L的目标dsDNA,耗时15 min。Cas9和dCas9常用于核酸检测,但此类技术的信号放大及输出过程较复杂。Cas12a 、Cas13a 、Cas14等具有反式切割活性的发现为开发更简便、快速、精准的基于CRISPR-Cas系统的检测平台提供更多可能。

基于CRISPR-Cas12/Cas13/Cas14系统的检测技术通常利用Cas的反式切割活性直接切割带标记的检测探针,从而产生各种信号(如荧光、比色、电化学等),直接、快速地获得较高的检测灵敏度。KELLNER等[2]将重组酶聚合扩增技术(RPA)联合CRISPR-Cas13a系统,建立了SHERLOCK技术。该技术通过切割淬灭的荧光报告探针放大和输出检测信号,在寨卡病毒检测中可达到单碱基分辨率,并极大地提高了检测的灵敏度。此外,Cas12a同样具有强大的反式切割活性,CHEN等[14]将CRISPR-Cas12a系统联合RPA开发了DETECTR技术。SHERLOCK及DETECTR技术具有高灵敏度、高特异度和快速等优点,并为开发更多新的基于CRISPR-Cas系统的检测技术提供基础。但此类技术有两步反应,增加了检测过程中被污染的风险,进一步的研究可通过将核酸扩增过程与CRISPR检测过程整合于单一反应体系中进而降低检测过程被污染的风险。基于CRISPR-Cas系统的检测技术在实际应用中面临着复杂的核酸提取方式和检测程序,以及难以实现对单一crRNA及Cas进行多重靶标检测等挑战,这些挑战限制了新技术在实际样本检测中的应用。

3 病原微生物核酸检测的挑战

基于CRISPR-Cas系统的病原微生物核酸检测在临床应用上面临需开发简易的核酸提取方法,简化检测程序,建立多重检测平台等诸多挑战[7],笔者进一步讨论了目前的一些解决方案。

3.1核酸提取的简化 简化核酸提取过程仍然是快速核酸检测技术发展的主要瓶颈,因此需要开发快速高效的核酸提取方法促进基于CRISPR-Cas系统的检测技术的应用。MYHRVOLD等[15]建立了样本加热消除核酸酶非提取(HUDSON)技术,将HUDSON与SHERLOCK技术联合,在提取和纯化DNA或RNA的情况下裂解病毒,可以直接从临床样本中检测病毒核酸,极大地简化了操作步骤,降低了气溶胶污染的风险。然而,HUDSON技术缺乏纯化和浓缩核酸的步骤,可能会降低检测复杂样本中目标核酸的能力。纳米材料和技术可以通过简便的工艺从复杂样品中提取目标核酸。纳米级的隔离膜具有较大的比表面积,RODRIGUEZ等[16]开发了基于纸张核酸扩增的流控芯片技术,该技术使用的隔离膜通过静电作用和氢键结合力将高盐溶液中的目标核酸快速、高效地分离,使吸附在膜上的核酸保持稳定的结合,通过环介导等温扩增(LAMP)技术在原位扩增,实现目标序列的富集、纯化和扩增,完成从样品到结果的集成检测。目前,芯片上的等温放大步骤需要外部热源,该技术使用加热模块来辅助等温扩增,因此,若在基于纸张的微流控检测平台中整合一个集成的加热系统将大大加强其便携性。

3.2检测过程的简化 大多数基于CRISPR-Cas系统的检测技术仍然使用标准的两步检测法,此类方法增加了检测的时间和检测过程中交叉污染的风险,这促使研究者开发单管检测策略。常规两步检测法首先利用核酸扩增技术提高靶标的浓度,再联合CRISPR-Cas系统产生放大的检测信号[2]。但核酸扩增技术扩增靶标的同时,还增加了非特异性扩增的风险,故研究者们开发了无须靶标扩增的超灵敏的检测方法。

3.2.1单管检测策略 基于CRISPR-Cas系统的单管检测技术将核酸扩增和CRISPR-Cas系统反应整合于一个缓冲体系,用于快速现场检测。单管检测是在反应管底部添加核酸扩增试剂,在反应管盖上也添加Cas12a和crRNA试剂,反应管底部的核酸扩增完成后,将预先加在管盖上的Cas12a和crRNA试剂通过离心移至管底,使Cas12a和crRNA试剂与扩增子混合,实现在1管内完成扩增和检测,避免了气溶胶污染[17]。但此技术先进行靶标扩增再将扩增产物与CRISPR-Cas系统反应,检测时间较长。因此,研究者们将靶标的扩增与CRISPR-Cas系统整合于一个缓冲系统中同时进行反应,缩短了检测时间。根据核酸扩增步骤和CRISPR-Cas系统反应的温度偏好,JOUNG等[18]将LAMP介导的核酸扩增反应(55～65 ℃)与耐高温的Cas12b(31～59 ℃)集中于一管中同时完成核酸扩增与信号检测,建立了单管检测技术。该技术不但降低了交叉污染的风险,还明显缩短了检测时间。同样,该技术的核酸扩增过程也需要加热,未来的研究可通过开发集成加热系统,进一步简化工作流程,进而在不同环境下均可进行相关核酸检测。

3.2.2无扩增检测策略 无核酸扩增步骤的检测策略具有快速、避免非特异性扩增、不易产生交叉污染等优势,但可能会造成检测灵敏度下降。为解决灵敏度下降这一问题,研究者们通常使用超灵敏信号报告系统、信号级联放大技术,以及微小体积等方式提高灵敏度[13]。首先,电化学传感器、金属纳米材料、高性能的表面增强拉曼散射技术等可放大来自CRISPR-Cas系统的微弱信号,超灵敏地检测低浓度靶标。其次,因实验中CRISPR-Cas系统反应速率与Cas-crRNA复合物的数量呈正比,基于CRISPR-Cas系统的检测用多个 Cas-crRNA复合物直接靶向目标序列的不同位点,通过加快信号积累速率,在更短的时间内达到检测信号阈值[19]。此外,根据Cas的反式切割活性与底物浓度呈正比的原理,空间限制检测体系可浓缩底物进而提高检测灵敏度[20]。不同无扩增策略的组合可提高检测的灵敏度。基于CRISPR-Cas系统的无扩增数字RNA检测技术通过采用多个Cas13a-crRNA复合物靶向多个位点在空间限制体系(反应体积减小到nL水平)中检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),检测限为5 fmol/L,耗时5 min[21]。因此,合理整合上述策略可以实现无扩增、快速、灵敏的靶标检测。但由于缺乏靶标扩增步骤,用来增加灵敏度的策略可能会增加检测方法的复杂性和费用,在选择或设计检测方法时,必须综合考虑这些策略的优缺点。

3.3多重检测 多重检测可以提高诊断效能,实现大规模样本的高通量检测。GOOTENBERG等[22]利用PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b和Cas12a分别切割富含特定核苷酸序列的报告探针,实现了四重检测。但在该检测方法中,Cas的反式切割可能会产生信号重叠以降低检测的特异度,且该技术涉及较多的蛋白质种类,导致检测成本较高。因此,一种通过DNA阻断剂调控Cas反式切割活性的检测方法以单一蛋白实现了多重靶标的检测一定程度上降低了检测成本。HAN等[23]开发了一种基于Cas12a-DNA阻断剂的多重检测(CASTI)技术。CASTI可以通过联合RPA扩增靶标,以一种Cas实现人乳头瘤病毒(HPV)16和HPV18基因的检测,检测限为1 amol/L。该多重检测平台有助于在设备有限的条件下进行病原微生物的检测。然而,与检测人工合成的DNA靶标相比,该技术在细胞系和临床样本中检测目标DNA的效率较低,因此,需要进一步优化实验条件以避免样本中其他DNA或RNA的干扰。此外,ACKERMAN等[24]将核酸多重评估的组合排列反应(CARMEN)联合CRISPR-Cas13a系统,开发一种多通道检测方法(CARMEN-Casl3)。CARMEN-Casl3已可同时检测169种人类病毒,还能区分多种亚型的流感病毒,检测时间为5 min。CARMEN-Cas13的灵敏度和特异度可与SHERLOCK技术匹配,这对病原微生物高通量检测及流行病学研究至关重要。该技术可检测来自不同人群的数千份样本,需要专业人员对检测结果进行仔细分析解释。该技术若能与移动电话应用程序连接将直接读出检测结果,会有更大的应用潜力。

4 基于CRISPR-Cas系统相关的病原微生物非核酸分析物检测

病原微生物及其抗原和血清学抗体等非核酸分析物往往在发病早期和治疗开始后以低浓度出现。灵敏和可定量的基于CRISPR-Cas系统的检测技术有助于发现早期病变和准确评估疾病疗效[25]。近年来,基于CRISPR-Cas系统的检测技术已用于检测多种类型靶标,包括病原体、抗原、血清学抗体等。

4.1基于CRISPR-Cas系统相关的病原微生物直接检测 基于CRISPR-Cas系统的病原微生物直接检测常通过抗体或适配体识别致病菌,再与CRISPR-Cas系统联合放大检测信号,实现免培养、免提取的病原微生物直接检测。基于抗体的检测方法利用抗体对靶细菌识别,通过免疫夹心法联合CRISPR-Cas12a系统输出检测结果。DUAN等[26]开发了一种基于CRISPR-Cas12a系统引导、无DNA提取和扩增、可快速直接检测病原体的生物传感器(CATCHER)。CATCHER通过免疫夹心结构(标记鼠伤寒抗体的磁珠、靶细菌、标记鼠伤寒抗体和DNA核酸内切酶Ⅰ的胶体金),经磁分离后巧妙地利用DNA核酸内切酶Ⅰ将溶液中单链DNA激活探针降解为短寡核苷酸,改变CRISPR-Cas12a系统生物活性,进而输出检测结果,检测限为7.9×101CFU/mL。该方法为非核酸分析物的检测提供了一个通用平台。相比价格较贵的抗体识别方法,适配体识别方法成本较低且步骤更简便。基于适配体的方法,研究者通常识别适配体靶标后释放一个DNA或RNA激活探针用于激活CRISPR-Cas系统,进而完成信号的放大及输出。SHEN等[27]开发了将核酸变构探针(AP)与CRISPR-Cas13a系统联合的APC-Cas检测方法。该方法通过AP识别靶细菌后暴露引物结合位点,引物在DNA聚合酶和T7 启动子作用下进行DNA序列的延伸和转录,产生大量单链RNA激活探针及CRISPR-Cas13系统,通过荧光信号输出结果。该技术可快速、直接、定量检测各种样本中肠炎单胞菌数(1～105CFU/mL)。以上病原微生物直接检测技术省去了检测前核酸提取和扩增步骤,明显缩短了检测时间。

4.2基于CRISPR-Cas系统相关的病原微生物抗原检测 病原微生物抗原与致病力密切相关,抗原检测也是传染性疾病诊断的主要方式之一。基于CRISPR-Cas系统的检测技术检测抗原时大多需利用适配体识别抗原后将抗原转化为核酸信号,联合CRISPR-Cas系统放大检测信号,实现抗原快速检测。生物毒素是细菌产生的一类重要抗原,会引起人类急性中毒、致癌或致畸等,生物毒素的检测有助于评估细菌感染严重程度和预防毒素引发的休克。ABNOUS等[28]利用核酸适配体联合CRISPR-Cas12a系统识别黄曲霉毒素M1(AFM1),开发了简便、高效的抗原检测技术。在添加了AFM1的牛奶样品中,该技术在 0.5～50.0 ng/L呈现出较宽的线性关系。该技术利用比色法,通过颜色的变化输出检测结果,不需要昂贵设备,信号输出方式简便,便于现场检测,但比色这一信号输出方式灵敏度相对较低。研究者可探索使用包括金属有机框架在内的新型纳米材料来提高传感器的灵敏度。此外,病毒抗原往往决定了病毒的宿主、组织嗜性及其致病的能力,也成为检测的重要靶标。通过适配体联合CRISPR-Cas12a系统,研究者建立了SARS-CoV-2抗原的电化学检测平台[29],实现核衣壳蛋白的检测。与常规抗原检测法相比,基于CRISPR-Cas系统的抗原检测技术提高了抗原检测的特异度和灵敏度,并可对抗原进行定量检测。

4.3基于CRISPR-Cas系统相关的病原微生物抗体检测 抗体检测在疾病诊断、疗效评估和流行病学调查中具有重要意义。BARBER等[30]建立了CRISPR-Cas9系统介导的自组装固定肽(PICASSO)技术。PICASSO技术通过将能与靶分子特异性结合的重组肽段与dCas9融合形成复合物,利用sgRNA引导该复合物与微阵列表面上特定位置的DNA进行自组装,构建DNA-蛋白质微阵列,用于检测不同抗体。PICASSO技术能快速识别样本中的上千种抗体,实现了病原微生物血清学抗体快速高通量检测。PICASSO技术已被用于检测新型冠状病毒感染(COVID-19)恢复期患者血清SARS-CoV-2的抗体。但该技术难以避免非特异性背景信号,未来的研究可通过改变微阵列表面寡核苷酸的间距密度及dCas9与其融合蛋白之间的连接长度等进一步优化实验条件,提高检测特异度。

5 总结与展望

基于CRISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物核酸和非核酸靶标的检测中迅速发展,实现对超低浓度样品的精确、灵敏检测。本文归纳了基于CRISPR-Cas系统的检测技术的构建和应用,讨论了该技术目前存在的挑战及可能的解决办法,进一步阐述了基于CRISPR-Cas系统的检测技术在病原微生物非核酸分析物检测方面的最新研究热点。核酸靶标的检测通过开发简易的核酸提取方法,简化检测程序,建立多重检测平台等方式提高了检测性能。非核酸靶标的检测则需通过适配体、抗体及其他方式将靶标转换成核酸信号进一步完成检测,在病原微生物检测领域展现出了更广阔的应用前景。

尽管CRISPR-Cas系统在病原微生物检测中具有各种优势,但仍有一些挑战需要克服。(1) 靶基因片段选择的局限性。CRISPR-Cas系统在Cas锚定目标序列时依赖于PAM,在选择检测的靶基因片段时存在一定的局限性。(2)crRNA 和单链DNA、单链RNA报告探针在添加RNA酶抑制剂的临床复杂样本中仍存在降解风险。(3)Cas存在一定的背景活性,不同批次的背景活性不同,导致样品检测结果不同。

基于CRISPR-Cas系统的检测技术在临床应用上具有巨大的潜力。基于CRISPR-Cas系统的检测技术与人工智能相结合,可以促进感染性疾病的早期诊断,直接向卫生专家甚至普通人群发出警报。此外,基于CRISPR-Cas系统技术的检测结果可以通过移动电话应用程序连接到云数据进行分析和储存,可用于构建医疗大数据分析平台,为临床诊疗及科学研究提供有力证据。CRISPR-Cas 系统现在能够检测的不仅是基因组材料,还有望扩展到更多领域。除病原微生物及其抗原和血清学抗体等非基因组目标外,CRISPR-Cas 系统在癌症生物标志物、人体样本罕见突变、食品水样污染检测、植物病原微生物检测等领域的新应用仍有待进一步探究。