ABO正反定型不符的白血病患者血型鉴定与临床分析

李 茜,张智慧,高力立,彭沫溱,陈 璐,赵梓昕,寸 伟,罗 臻,苏品璨

云南昆明血液中心输血研究室,云南昆明 650106

输血作为一种临床救治患者的常用治疗手段,既可提高患者携氧功能,又能改善其凝血功能障碍,因此,输血前的ABO血型鉴定对保障临床输血安全尤为重要。ABO血型是由ABO基因编码决定的,一般情况下人体ABO血型不会发生改变。白血病是起源于造血干细胞或祖细胞的恶性克隆性疾病[1-2],白血病患者处于疾病状态可能引起自身体内血细胞或血浆成分发生改变,导致ABO抗原减弱或ABO抗体效价降低,出现ABO血型鉴定正反定型不相符的情况,极易引起血型误判,直接关系临床输血安全[3-4]。多种因素均可导致患者ABO抗原减弱,近年来,有研究发现,ABO基因启动子区甲基化程度与ABO抗原表达异常有关[5-8],但相关文献报道较少见。本研究通过血清学、聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)检测和ABO基因启动子区甲基化状态检测等检测手段对1例白血病患者的ABO血型鉴定检测异常结果、原因及处理方法进行了分析,初步探讨了白血病中ABO基因甲基化状态异常导致ABO抗原表达减弱在输血相容性检测中的临床意义,以期为临床诊疗提供参考依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 血液标本来源于云南省肿瘤医院,患者,女,24岁,患恶性血液病,有2次输血史,患者知情同意本研究并签署知情同意书。患者于2022年2月3日初次诊断为白血病,目前患者白细胞计数(WBC)为206×109/L,血红蛋白(Hb)为51 g/L,血小板计数(PLT)为38×109/L,同时伴有脾脏肿大。患者严重贫血,急需输血,因其ABO血型鉴定正/反定型不一致(正定型结果为O型,反定型结果为A 型),医院将患者血液标本送检至血液中心进行ABO血型鉴定和疑难交叉配血实验。

1.2仪器 ABO血型定型检测卡配套孵育器和离心机(长春博迅生物技术有限责任公司),KA2200 型血型血清学专用离心机(日本久保田公司),电热恒温水浴箱(上海博迅实业有限公司),冰箱(海尔集团海尔电冰箱有限公司),MagCore HF16 自动核酸提取仪(中国台湾RBC Bioscience公司),T100 PCR反应扩增仪(美国Bio-Rad Laboratories公司),PowerPac TM 基础电泳仪(美国Bio-Rad Laboratories公司),ChemiDoc XRS+凝胶成像系统(美国Bio-Rad Laboratories公司),3730测序列分析仪( 美国ABI公司),SW-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂),DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司),DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司),YXJ-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司),H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂),U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司),移液器(范围100～1 000 μL,20～200 μL,0.5～10 μL,德国艾本德EPPENDORF公司)。

1.3试剂 抗-A、抗-B血型定型试剂-单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号20220101),ABO血型卡正/反定型和RhD血型检测卡-微柱凝胶法(DiaMed GmbH/Bio-Rad低离子抗人球蛋白卡,批号50093.11.28),抗-A1凝集素(上海血液生物医药有限责任公司,批号20221019),抗-H单克隆抗体(上海血液生物医药有限责任公司,批号20221110),抗-AB抗体(DIAGAST,批号464000),抗人球蛋白[抗免疫球蛋白G(抗-IgG),抗-C3d]检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20225001),抗-IgG检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20215102),抗C3d检测试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20225201),人ABO血型反定型用红细胞试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司,批号20235313),低离子抗人球蛋白卡-微柱凝胶法(DiaMed GmbH/Bio-Rad,批号50531.76.10),不规则抗体检测试剂(人血红细胞,长春博迅生物技术有限责任公司,批号20221208),红细胞血型抗体筛选细胞(微柱凝胶法)Serascan Diana 3(Diagnostic Grifols,S.A.西班牙基立福公司,批号23007.01);核酸提取试剂盒(中国台湾RBC Bioscience 公司,批号 P4101- 17230);人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒PCR-SSP法 (天津秀鹏生物技术开发有限公司,批号202004001),MethylEdgeTMBisulfite Conversion System(Promega,批号0000470334),焦碳酸二乙酯处理水(碧云天 Beyotime,批号111122230306),TaKaRa EpiTaqTMHS (TaKaRa,批号AM20984A),加样缓冲液(Takara,批号ALG988A),BigDye测序反应试剂盒(ABI 公司,批号91235489),POP 7测序胶(ABI 公司,批号2211711),10×电泳缓冲液(ABI 公司,批号2208378)。

1.4检测方法

1.4.1血型血清学检测 采集患者肘部静脉血进行检测,ABO血型正/反定型鉴定、间接抗人球蛋白试验、不规则抗体筛查采用微柱凝胶卡法和试管法;直接抗人球蛋白试验(DAT)采用试管法;将抗-A、抗-B分别与经盐水洗涤3次的受检者浓缩红细胞等量混合进行吸收放散试验。所有试验操作均按照标准操作规范[9-10]和试剂盒说明书进行。

1.4.2PCR-SSP检测 取患者乙二胺四乙酸外周抗凝全血400 μL,使用自动核酸提取仪提取基因组DNA,采用微量紫外分光光度计检测 DNA 浓度和纯度。按照人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒说明书进行PCR-SSP 法基因分型PCR扩增试验。配制2.0%的琼脂糖凝胶,将5 μL扩增PCR产物进行电泳检测,于120 V恒定电压条件下电泳40 min后使用凝胶成像系统成像,记录试验结果并根据试剂盒说明书结果分型表判定基因型。

1.4.3ABO基因启动子区甲基化检测 采用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测标本ABO基因启动子区CpG岛甲基化状态。根据MethylEdgeTMBisulfite Conversion System试剂盒说明书,对患者基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰,使检测标本基因组DNA中未发生甲基化的胞嘧啶通过亚硫酸氢盐处理后转化为尿嘧啶,甲基化的CpG胞嘧啶则不变。在NCBI数据库下载ABO基因序列,应用Methyl primer express software v1.0和MethPrimer软件选取ABO基因启动子区富含CpG位点的区域,并设计扩增引物,检测片段分别为175、160 bp,共包含13个CpG位点,分别编号为1～13,扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上游引物序列1:ATGTTGTTTAGGTTGGAGTGTAGTG,下游引物序列1:ACCAACATAATAAATCCTCCATCTC;上游引物序列2:TTTTAAGTAGTTGGGGTTATAGAT,下游引物序列2:ACCTACAATCCTAACACTTTC AA。以亚硫酸氢盐修饰后的患者基因组DNA为模板,根据TaKaRa EpiTaqTMHS说明书要求扩增目标序列。PCR反应体系为50 μL,包括亚硫酸氢盐修饰后DNA模板2 μL,TAKARA EpiTaqTMHS(5 U/μL) 0.25 μL,10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)5 μL,25 mM MgCl25 μL,2.5 mM dNTP Mixture 6 μL,上下游引物各2 μL,其余用无菌水补足。PCR条件为94 ℃,1 min;98 ℃,10 s;57 ℃,30 s;72 ℃,30 s;40个循环;72 ℃ 终延伸10 min;终止在4 ℃。将PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳后对目的条带进行切胶,使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化回收;使用HieffCloneTMZero TOPO-TA Cloning Kit试剂盒对目的片段进行目的片段TA克隆;使用生工质粒提取试剂盒SK8191 UNIQ-10 柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA;将质粒使用PstⅠ单酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小,确定是否含有目的片段,鉴定阳性克隆子;将阳性克隆子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析。

1.5统计学处理 采用Chromas(Version 2.3)软件分析测序峰图,使用甲基化分析软件BIQ Analyzer分析目标序列CpG位点甲基化情况,并将BSP测序结果以圆圈图输出。目标序列中有13个CpG岛位点,计算CpG岛甲基化位点数占总CpG岛位点的百分比,计算甲基化率。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ABO血型鉴定 患者ABO 血型正定型结果为O型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致,4 ℃时试管法可见A1c凝集。见表1。不规则抗体筛查试验结果显示,患者血浆与3种抗体筛查细胞均无凝集。见表2。DAT结果显示,抗-IgG+C3d、抗-IgG、抗-C3d均为阴性。吸收放散试验结果显示,患者红细胞表面存在A抗原。见表3。

表1 ABO血型鉴定正反定型结果

表2 不规则抗体筛查试验结果

表3 受检者吸收放散试验结果

2.2PCR-SSP法检测 ABO基因分型检测出患者PCR-SSP基因分型格局1、2、4、6、8、9、11孔为阳性,3、5、7、10孔为阴性。对照人类红细胞 ABO 血型基因分型试剂盒(天津秀鹏生物技术开发有限公司)结果分型表判定患者基因型为AO1,表型为A型。见图1。

注：片段大小从下至上依次为100、250、500、750、1 000 bp和2 000 bp;检测目的条带均同时检测内参质控带,内参为人类生长激素基因的保守片段,大小约为1 000 bp。

2.3ABO基因启动子区甲基化检测 经BSP检测ABO基因启动子区部分序列的甲基化水平,待检测标本DNA经亚硫酸氢盐试剂盒转化处理后甲基化的胞嘧啶不发生改变,经PCR扩增和TA克隆测序检测到该CG位点仍为CG;而未甲基化修饰的胞嘧啶则转化为尿嘧啶,经PCR扩增和TA克隆测序检测到该CG位点转化为TG。检测标本的甲基化率指检测区域中甲基化的CpG数量与该区域CpG总数量的比值。将ABO基因启动子富含CpG岛区域检测片段大小为175、160 bp序列进行TA克隆测序。见图2～4。甲基化状态分析结果显示,患者标本ABO基因启动子区甲基化率为66.7%,高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率(<25%),差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：箭头表示该CG位点的C为甲基化的碱基。

注：箭头表示CG位点的C未被甲基化,CG转化为TG。

注：DZ1、DZ2、DZ3、DZ4、DZ5为对照组标本,SC为受检白血病患者标本;○为非甲基化位点,●为甲基化位点;图中分别为患者标本和正常对照组标本ABO基因启动子175 bp和160 bp区域甲基化状态分析情况。

注：与正常对照组比较,aP<0.001。

3 讨 论

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病,由于发生病变的白细胞失去分化成熟的能力,停滞于其发育的不同阶段,进而引起患者骨髓和其他造血组织中病变细胞大量增殖积聚并浸润其他器官和组织,导致患者造血功能异常,出现病态造血而无法产生足量的正常血细胞,临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状,输血是白血病非常重要的辅助治疗手段之一[1-2]。在临床输血治疗过程中ABO血型的正确鉴定尤为重要。人类ABO血型抗原由ABO基因编码,ABO基因位于人类第 9号染色体的长臂,属于常染色体显性遗传,一般情况下不会发生变化[11]。有研究表明,急性髓系白血病患者处于其病情发作期可能出现红细胞血型抗原减弱、消失或变异,其原本的ABO血型抗原无法正常检出,导致ABO正/反定型不一致,极易引起血型误判,影响输血安全[12]。近年来,分子生物学基因分型技术、血型基因甲基化检测技术在ABO疑难血型鉴定中的广泛应用,其将新技术与传统血型血清学鉴定技术相结合,可快速、准确地鉴定疑难ABO血型,并且进一步合理解释疾病状态下抗原减弱的原因,为更加安全、合理地解决临床疑难血型鉴定问题提供了新思路。

本例患者使用微柱凝胶法进行ABO血型鉴定试验结果显示,正定型结果为O型,反定型结果为A型,正反定型结果不一致。排除微柱凝胶卡、反定型试剂、离心设备运行及其他人为因素的干扰后采用试管法分别于室温、4 ℃和37 ℃条件下重复ABO正反定型试验,结果显示,3个温度下正定型均为O型,而反定型在4 ℃时试管法可见A1c凝集,推测患者产生不规则抗-A1抗体。微柱凝胶法进行不规则抗体筛查和试管法进行直接抗人球蛋白试验结果均为阴性,排除是自身抗体造成的ABO正反定型不符[13]。结合患者处于白血病发作期,其ABO血型鉴定正反定型不符可能是红细胞本身所致,经吸收放散试验后检出患者红细胞表面存在弱 A 抗原。基于血液免疫学检测试验,由白血病疾病状态下导致受试者A抗原减弱与ABO亚型引起的红细胞抗原数量减少的试验检测结果较为相似,难以鉴别,需进一步结合其他检测技术加以鉴别。本研究使用分子生物学血型基因分型PCR-SSP法进行检测,本例患者ABO基因分型结果为AO1,表型为A型,即可排除ABO亚型的可能,而其正定型结果为弱A表型,有研究在髓系恶性肿瘤[4]、骨髓增生异常综合征[14-15]、急性髓系白血病[15-16]、慢性粒细胞白血病[17]、膀胱癌[18]和口腔癌[8,19]等患者中均检测到ABO抗原减弱的现象,与本研究结果一致。

目前,对于血型抗原减弱的确切原因尚未明确,且患者出现ABO抗原减弱的现象不是持续的,在疾病缓解后还有可能恢复血型抗原表达[20]。推测为机体在白血病状态下的ABO基因表达调控机制发生了改变,而这种调控机制目前尚未明确。近年来,甲基化已成为肿瘤研究的热点,甲基化是一种表观遗传修饰方式,参与机体疾病状态下的基因表达调控。有研究发现,白血病患者ABO抗原减弱与DNA甲基化导致ABO基因沉默的关系更为密切[18]。基于此,推测患者ABO基因启动子区CpG岛甲基化状态的异常可能与其A抗原表达减弱有关。本研究对患者标本ABO基因启动子区175、160 bp 2个区域甲基化状态进行检测,结果显示,检测区域患者标本ABO基因启动子区甲基化率为66.7%,明显高于随机选取的5例正常对照组标本平均甲基化率(<25%),差异有统计学意义(P<0.05)。有研究表明,ABO基因启动子CpG岛甲基化程度与ABO抗原表达呈负相关,甲基化程度越高ABO基因表达越不活跃,从而导致A、B抗原表达均减少[5,8,18];且白血病患者存在不同程度A、B抗原减弱[21],与本研究结果一致。提示患者白血病状态下ABO基因启动子区甲基化程度增高可能与ABO抗原减弱之间存在较为密切的相关性,因机体抗原减弱的调控机制是多因素共同作用的结果,而ABO启动子甲基化导致的基因表达下调仅可能只是ABO抗原减弱的其中一个因素,其机制还需进一步探索。

本研究结果提示,本例白血病患者在疾病发作期,其ABO基因启动子区甲基化状态异常可作为导致ABO抗原减弱的重要因素之一,从而干扰ABO正反定型鉴定。在临床输血实践中开展血清学疑难血型鉴定的同时进行分子生物学基因分型和血型基因甲基化检测可作为血清学方法的有效辅助手段,有效缩短了输血相容性试验检测时间,保障临床用血安全、合理、有效,为实现患者个体化血液管理、做到精准输血提供了新思路。