子宫内膜良性病变中环状RNA的作用机制研究进展*

郭正晨,段 华

(首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院妇科微创中心,北京 100006)

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类在反向剪接过程中形成的具有闭合环状结构的内源性RNA,区别于线性RNA,因其具有稳定性、特异性、进化保守性以及多种分子功能已成为研究热点。随着高通量测序技术和相关实验技术的不断发展,大量研究已证实circRNA在众多病理过程中发挥关键作用,同时其在子宫内膜良性病变发生发展中的关联已得到初步探究。

1 CircRNA的分类与特征

CircRNA由非经典剪接方式——反向剪接线性mRNA前体产生,形成连续的闭合环状结构。根据染色体位置来源和组成不同,circRNA主要分为三种类型,最常见的是外显子环状RNA(exonic circular RNA,ecircRNA),由外显子组成,其他还包括内含子环状RNA(intronic circular RNA,ciRNA)(由内含子组成)和外显子-内含子环状RNA(exonic-intronic circRNA,eIciRNA)(由外显子和内含子共同组成)[1]。根据最新研究,circRNA具有以下显著特征:(1)多样性:不同基因能编码不同的circRNA,而由于可变剪接,同一基因还能编码具有不同外显子和内含子组合的circRNA,其中多数circRNA来源于外显子,为ecircRNA,且多位于细胞质[2];(2)丰度:由于反向拼接的效率远低于经典拼接方式,导致细胞和组织中circRNA的丰度普遍较低,但在某些特定部位,如神经系统中大量聚集,甚至远高于其同源线性mRNA[3-7];(3)稳定性和保守性;(4)表达时间和组织特异性[8]。以上circRNA特征提示了其潜在的生物学功能。目前已知circRNA可直接或间接通过与RNA和蛋白质的相互作用来调节基因表达,从而影响细胞的各种生物学功能。

2 CircRNA的功能

CircRNA作为细胞活性调节因子发挥作用,主要通过以下四个方面。

2.1 miRNA海绵 miRNA在基因表达的转录后调节中具有广泛作用,包括细胞增殖、代谢、迁移、分化和凋亡[9]。作为miRNA的上游分子,circRNA因含有miRNA应答元件,能结合各种miRNA并通过“miRNA分子海绵”机制抑制其活性[10-11]。如小脑变性相关蛋白1(cerebellar degeneration-related protein 1,CDR1)的反义转录本,又称为CIRS-7,是研究者发现的首个具有miRNA海绵功能的circRNA,能负性调节miR-7[11]。最新研究证实,CIRS-7/miR-7在多种良恶性疾病中发挥促增殖转移作用,如骨关节炎、胃癌、非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌等[12-15]。此外,随着高通量测序技术的广泛应用,目前已发现circPTN、circZNF532、circORC5、circWHSC1、circRNF20等多种circRNA的分子海绵作用。

2.2 与蛋白质相互作用 RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)是一类参与RNA代谢调节的蛋白质,如RNA的形成、运输、定位和翻译[16]。CircRNA与RBP的结合具有双向效应,既调节circRNA代谢,又影响RBP功能。Errichelli等[17]在体外小鼠运动神经元中发现FUS蛋白能通过结合反向拼接连接处侧翼的内含子调节多种circRNA的生物合成。CircRNA与RBP的结合还能影响RBP的功能。circ-Amotl1能与致癌转录因子c-Myc相互作用,促进c-Myc在细胞核中的稳定性并上调c-Myc靶点[18],还与信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)相互作用以同样的方式调节STAT3的生物功能[19]。circACTN4在肝内胆管癌中高表达,并且能与Y盒结合蛋白1(Y-Box binding protein 1,YBX1)相互作用,将YBX1募集到卷曲受体7(frizzled-7,FZD7)基因的启动子区域,促进作为Wnt/β-连环蛋白信号通路关键调节因子的FZD7表达,增强了肿瘤的增殖和侵袭能力[20]。总的来说,某一种circRNA能与不同的蛋白质相互作用,而某一种RBP也可与不同的circRNA动态结合。但是鉴于分析RBP中circRNA的结合序列具有挑战性,对circRNA与RBP相互作用的研究仍有限。

2.3 调节基因表达 CircRNA能通过多种机制调节基因表达。首先,circRNA能影响亲本基因的转录。在U1核小RNA的帮助下,细胞核内的外显子-内含子环状RNA EIciPAIP2和EIciEIF3J能通过RNA-RNA相互作用影响RNA聚合酶Ⅱ的活性,调节其亲本基因的转录[21]。其次,circRNA还可从翻译水平影响基因表达。研究发现,circVAMP3在应激条件下可抑制原癌基因c-MYC的翻译从而降低c-Myc蛋白的表达水平[22]。Yes相关蛋白(yes-associated protein,Yap)是Hippo通路的关键组成部分,抑制Yap活性可促进肿瘤细胞的凋亡、抑制增殖和转移。circYap能与翻译相关蛋白PABP、eIF4G结合,阻止其对Yap mRNA的翻译起始作用,使Yap蛋白表达水平下降从而抑制肿瘤生长[23]。再次,circRNA还可能通过改变DNA修饰影响基因表达。弗氏白血病病毒整合蛋白1(friend leukemia virus integration 1,FLI1)是红细胞转化特异性转录因子家族成员,在血液系统恶性肿瘤中起致癌驱动作用,并促进实体瘤生长。在乳腺癌中,circRNA FECR1可降低甲基转移酶的表达并将去甲基化酶TET1募集至FLI1的启动子处,导致FLI1基因启动子区的去甲基化,提高了FLI1表达水平,促进肿瘤生长[24]。综上,circRNA可以不同的方式调节基因表达,但尚未发现circRNA对DNA复制的影响。

2.4 作为翻译模板编码蛋白 早期研究认为,circRNA因缺乏5'端帽子结构和3'端多聚A尾结构而无法进行蛋白质翻译,属于非编码RNA。但是,近年越来越多的研究发现,circRNA序列中因含有某些特殊序列而具有直接翻译潜能,包括含有编码蛋白质潜能的开放阅读框序列(open reading frame,ORF),该序列能引导核糖体进入RNA的内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry sites,IRES),还可触发不依赖帽子结构转录过程的m6A修饰的核苷酸序列[25]。多项研究已证实了circRNA的翻译活性。如circPPP1R12A来源于蛋白磷酸酶1调节亚单位12A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A,PPP1R12A)的前体mRNA。研究发现,circPPP1R12A序列中包含ORF,可编码一种新的多肽,命名为circPPR12A-73aa,这种多肽可激活Hippo-YAP信号通路,促进结肠癌细胞的增殖和转移[26]。另有发现circ_022705由F-box和WD重复结构域包含7(F-box and WD repeat domain containing 7,FBXW7)基因的外显子产生,称为circFBXW7。circFBXW7在三阴性乳腺癌组织中下调,并由IRES介导翻译编码FBXW7-185aa,该蛋白可通过增加FBXW7的丰度和诱导c-Myc降解来抑制三阴性乳腺癌症进展[27]。

目前已知大多数circRNA发挥分子海绵作用,通过miRNA调节蛋白水平,少部分circRNA起到与RBP结合、调节基因表达及蛋白质翻译作用,且相关研究仍正在不断增加。多数circRNA发挥单一功能,也存在circRNA同时进行多种功能影响细胞活性。Wang等[28]研究发现,circSEMA4B既可编码一种新的蛋白质SEMA4B-11aa,抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,又可发挥海绵作用,通过miR-330-3p/程序性细胞死亡因子4通路抑制Akt的磷酸化,负性调控PI3K/Akt信号通路,抑制乳腺癌组织生长、复发和转移。此外,还有研究发现circRNA存在表观修饰。研究者在宫颈癌组织中发现m6A修饰的circCCDC134稳定性增加,作为miR-503-5p海绵,刺激低氧诱导因子转录,促进宫颈癌生长和转移[29]。CircRNA功能及其调节仍有待研究,明确其在疾病中的作用至关重要。

3 CircRNA与子宫内膜异位症

3.1 促进内膜细胞的增殖侵袭能力 上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程已在子宫内膜异位症中得到广泛研究,被证实能促进异位内膜细胞的增殖和迁移[30]。Circ_0004712在子宫内膜异位症异位病灶中高表达,并作为miRNA海绵大幅下调miR-488-3p水平,上调Rho相关卷曲螺旋包含蛋白激酶1(rho associated coiled-coil containing protein kinase 1,ROCK1)的活性,激活RhoA/ROCK1/2通路,增强雌激素/雌激素受体α/ERK信号通路介导的EMT过程,最终促进子宫内膜异位上皮细胞的增殖和转移[31]。circZFPM2可通过miR-205-5p/锌指E盒结合同源盒1信号通路诱导EMT并促进异位内膜细胞增殖、迁移和侵袭级联反应[32]。以上研究表明,circRNA对子宫内膜异位症细胞活性的调控主要通过发挥海绵作用调节EMT过程。

3.2 作为子宫内膜异位症的诊断标志物 迄今为止,子宫内膜异位症研究众多,但仍无有效的诊断标志物或治疗方法。有研究通过对来自子宫内膜异位症患者的在位内膜和正常患者的子宫内膜进行circRNA测序研究筛选出了circ_0004712和circ_0002198[33]。两种circRNA在疾病组表达升高,并且通过计算受试者工作特征曲线下面积得出circ_0004712诊断子宫内膜异位症的灵敏度为0.704,circ_0002198诊断灵敏度为0.846,初步证实了其作为新型标志物的诊断潜能。

3.3 参与子宫内膜异位症相关不孕 不孕是子宫内膜异位症最主要的临床表现之一,其机制尚不明确。已有研究发现子宫内膜异位症患者卵泡发育异常,而卵丘细胞在卵母细胞的发育中起着不可或缺的作用,卵丘细胞围绕着卵母细胞,并通过缝隙连接和旁分泌因子与卵母细胞建立双向功能相互作用。Wu等[34]通过提取子宫内膜异位症合并不孕患者卵丘细胞的RNA进行circRNA测序研究,发现与对照组卵丘细胞相比,96种circRNA差异表达并且其功能与细胞生长和分化密切相关,涉及Rap1信号通路、MAPK信号通路和Hippo信号通路。

CircRNA在子宫内膜异位症中的研究仍集中于表达以及miRNA海绵以发挥调控作用,并初步在内膜细胞活性、诊断性标记物以及不孕等方面得到探索。而是否存在circRNA其他功能以及对子宫内膜异位症相关雌激素异常、疼痛以及月经改变的影响需进一步研究。

4 CircRNA与子宫腺肌病

子宫腺肌病是一种常见的良性和难治性妇科疾病,其特征是痛经、月经过多和生育能力低下。尽管受到高度关注,仍缺乏对其发病机制的充分了解。目前子宫腺肌病相关circRNA研究极少。研究发现,circPVT1的高表达与子宫腺肌病患者的痛经、月经过多和子宫增大的严重程度密切相关。细胞实验证实circPVT1的敲除抑制了子宫腺肌病在位内膜上皮细胞和间质细胞的增殖和侵袭[35]。研究发现,子宫腺肌病患者中circ_0061140表达上调,下调circ_0061140可抑制子宫内膜上皮细胞的活性、增殖、侵袭和迁移,并引发了细胞凋亡,还可减少对miR-141-3p的吸收,提高miR-141-3p水平,由此增加对lin-28同系物B(lin-28 homolog B,LIN28B)的表达抑制,降低细胞活性[36]。CircRNA与子宫腺肌病的相关研究仅局限于对子宫内膜细胞功能的影响,对于子宫腺肌病其他病理机制,如免疫炎症、血管生成和EMT以及对子宫腺肌病特殊结构内膜-肌层交界区的影响尚待研究。

5 CircRNA与子宫内膜炎

子宫内膜炎是一种妇科常见的感染性和炎症性子宫内膜疾病。子宫内膜抵御微生物感染和组织损伤的初始防御依赖于固有免疫系统[37]。感染时,子宫内膜组织屏障的完整性破坏,抗炎能力持续下降。

5.1 通过TGF-β信号通路发挥抗炎作用 转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)和细胞内信号转导蛋白SMAD2/3在炎症中发挥重要作用,TGF-β1可通过激活SMAD3调节miRNA表达,从而抑制炎症的发生[38]。有研究使用大肠杆菌成功地建立了小鼠子宫内膜炎症模型,通过circRNA测序和实验验证筛选出子宫内膜炎小鼠组织中差异表达的circRNA,功能/通路富集分析发现circRNA主要参与RNA聚合酶POL Ⅱ启动子转录的正调控、细胞增殖的负调控等生物学过程及TGF-β信号通路。研究通过逆转录PCR实验进一步验证了小鼠子宫内膜炎组织中TGF-β1和SMAD3的mRNA上调和磷酸化的SMAD3水平显著降低[39]。这项研究表明circRNA在子宫内膜炎中发挥抗炎作用,为circRNA治疗子宫内膜炎提供新思路。

5.2 抑制炎症诱导细胞凋亡 子宫内膜炎症改变促使上皮细胞凋亡[40]。研究发现circFADS2和成熟miR-643在子宫内膜炎组织中表达升高,且两者表达呈正相关,提示circFADS2并非发挥分子海绵作用于miR-643。细胞实验进一步证实circFADS2过表达能增加成熟miR-643水平,同时两者能减少发生炎症反应细胞的凋亡[41]。由此可知,circRNA可能是抑制子宫内膜炎发生的重要靶点。

6 CircRNA与宫腔粘连

6.1 发挥抗纤维化作用 宫腔粘连发生的最主要病理改变是多种原因造成子宫内膜基底层损伤,子宫内膜发生粘连或纤维化。有研究通过RNA测序及实验研究在宫腔粘连组织中发现了多种差异表达的circRNA,进一步发现宫腔粘连子宫内膜间质细胞中circPlekha7显著上调,并且其过度表达增强细胞凋亡,降低细胞生存能力,同时抑制了细胞中纤维化相关蛋白α平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白和SMAD3的表达;而circPlekha7的敲除显示出相反的结果[42]。该研究结果表明circRNA在宫腔粘连中发挥了抗纤维化作用,并可能作为宫腔粘连患者的潜在预后生物标志物和治疗靶点。

6.2 在人脐带间充质干细胞治疗宫腔粘连中发挥促内膜修复作用 人脐带血间充质干细胞促进子宫内膜修复,改善其功能,已有临床研究证明基于该细胞治疗宫腔粘连的有效性和安全性[43]。CircRNA在人脐带血间充质干细胞中表达并影响子宫内膜修复。研究发现,circPTP4A2在人脐带血间充质干细胞中升高,并通过miR-330-5p/丙酮酸脱氢酶激酶2信号通路稳定线粒体代谢,有助于人脐带血间充质干细胞减少宫腔粘连小鼠模型的纤维化同时增加腺体生长[44]。研究提示,circRNA在人脐带血间充质干细胞中可增强其子宫内膜的修复作用,促进子宫内膜的修复和生长。

7 总结与展望

CircRNA功能复杂多样且受到表观遗传的调控,在子宫内膜异位症、子宫腺肌病、子宫内膜炎和宫腔粘连等子宫内膜良性病变中主要发挥分子海绵作用参与发病机制和病理过程的生物调节,但在子宫内膜息肉以及子宫内膜单纯性增生中尚无相关研究。因此,circRNA在子宫内膜良性疾病中的研究仍处于初期,能否成为诊疗靶点尚需进一步验证,circRNA的蛋白翻译功能、直接调节蛋白表达以及其与蛋白的相互作用是否在这些疾病中发挥作用仍有待研究。在未来,随着RNA研究技术的发展,将发现更多的circRNA及其编码蛋白,这些RNA及新型蛋白质在子宫内膜良性病变甚至是妇科疾病中的重要性也将日趋凸显。