三种肺结核实验室检测的方法学评价和临床应用价值

张晓坤, 李勰璘, 李筱慧

广州市荔湾中心医院检验科(广东广州 510170)

结核分枝杆菌具有抗酸性,是引起结核病的病原菌,传染性强,感染后可以侵犯全身器官,临床上以肺结核为主,目前感染情况呈上升趋势,结核病至今仍为重要的传染病及慢性疾病,是导致患者死亡的主要疾病之一。根据WHO的最新报告,全球每年约有上千万新发病例,将近有40%患者死亡。2014年中国新增肺结核病患者九十多万例,仅次于印度和印度尼西亚, 居全球第3位[1]。经济不发达地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂、酗酒和贫困等原因,发病率有上升趋势。中国十四五结核病防治规划提出的防治目标是到2030年肺结核发病率降低80%,患者病死率降低90%,任重而道远。在社区中心及基层医疗机构进行结核病的早检测、早诊断和结核分枝杆菌的耐药性检测,以达到早治疗早控制的目的。传统的结核分枝杆菌检测方法比较多,包括影像学、病理学、结核菌素试验、涂片镜检、结核菌培养等,但这些方法受限于假阳性、假阴性高,敏感度低,检测时间过长,无耐药结果,操作繁琐,实验室要求高,生物安全要求高等不足,临床诊治得不到实验室的有效支持。临床上常见治疗药物为利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素,利福平与异烟肼同时使用可以减少耐药菌的产生。近年来,快速分子检测技术得到广泛的应用,特别是结核分枝杆菌相关耐药基因快速诊断技术的广泛使用,2010年WHO推荐使用Xpert MTB/RIF方法,是一种快速检测结核杆菌和利福平耐药性的检验系统,针对利福平耐药核心区间RRDR设定引物、探针,进行扩增检测是否含有MTB及其是否对利福平耐药,可以全自动地对样本进行核酸提取纯化,在2 h内能提供检测结果,为全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链反应系统,用于结核菌的快速检测和利福平耐药性检测[2],经过多年实践,临床诊治取得显著成效,在耐多药结核病早期诊治中显示出重要的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 检测对象 留取2021年10月至2022年9月结核门诊及住院患者529例,其中男350例,女179例,年龄(41±11)岁。肺结核患者晨痰标本用专用的塑料痰瓶内送检,痰标本以脓痰或脓性黏液样痰为合格,痰量5 mL。分别用3种检测方法检测,结果进行统计分析。对照组为同时期随机选择的68例其他非结核肺部疾病(肺癌26例、肺炎32例、支气管炎症10例)患者,男41例,女27例,年龄(38±9)岁。以结核杆菌检测阳性为确诊依据,按《临床诊疗指南:结核病分册》[3]作出诊断。本研究经广州市荔湾中心医院医学伦理委员会伦理审查批准。

1.2 仪器与试剂 胰酶为上海生物工程公司生产;2 g/dL NaOH为自配;罗氏培养基为南京普朗公司生产;利福平药敏试剂为美国BD公司生产;Xpert MTB/RIF设备和试剂盒为美国Cepheid公司生产;抗酸染液为贝索公司生产。

1.3 检测方法 (1)嘱咐患者清晨漱口后留取1份晨痰样本,按《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[4]进行检测、鉴定与药敏试验,无菌试管取5 mL痰液加入2～4倍量2 g/dL NaOH加塞振荡液化,室温30 min消化灭菌,取0.1 mL以无菌操作均匀接种培养基斜面上,37℃温育,每周观察,有菌落生长者,经抗酸染色镜检报告抗酸分枝杆菌生长,若8周仍无菌生长报告阴性结果。(2)另取液化后的菌液1.1 mL加入1.1 mL的磷酸盐缓冲液中混匀,取0.1 mL进行涂片抗酸染色检测,取0.5 mL进行Xpert MTB/RIF系统检测[5]进行检测。(3)结果判读:涂片法报告结果根据抗酸染色涂片中结核菌的多少判别为4+、3+、2+、1+和阴性;培养法报告结果根据罗氏培养基有菌落生长,经抗酸染色镜检确认抗酸分枝杆菌生长,再进行药敏试验;Xpert MTB/RIF法(简称Xpert,下同)的结果以高水平、中水平、低水平、极低水平和未检出5个水平来表示,CT值<16,表示MTB检出值为高水平;CT值为16～22,表示MTB检出为中水平;CT值为23～28,表示MTB检出为低水平;CT值为29～38,表示MTB检出为极低水平;CT值>38,表示MTB未检出。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0软件进行统计学分析, 组间比较采用2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3种检测方法性能分析 Xpert法、培养法和涂片法的敏感度分别为40.64%(215/529)、35.35%(187/529)和15.31%(81/529)。Xpert法与培养法的检测敏感度差异无统计学意义(2=1.23,P>0.05),与涂片法差异有统计学意义(2=67.21,P<0.05)。见表1、2。

表1 3种检测方法结果比较 例

表2 3种检测方法性能评价 %

2.2 Xpert法性能评价 在529例肺结核患者中,涂片法检测出阳性样本81例,阴性样本448例。以培养法作为比较标准,在涂片法检测阳性样本中Xpert法检测的敏感度和特异度分别为98.70%(76/77)和75.00%(3/4), Xpert法与培养法的差异无统计学意义(2=0.167,P>0.05);在涂片法检测阴性的样本中,Xpert法的敏感度和特异度分别为94.74%(108/114)和 92.81%(310/334),Xpert法与培养法的差异有统计学意义(2=9.63,P<0.05);在全部529例肺结核Xpert法检测的样本中的敏感度为96.79%(181/187),特异度为91.52%(313/342)。见表3。

表3 Xpert法和培养法结果对比 例

2.3 Xpert法与涂片法结果的分析 为分析Xpert法与涂片法结果的对应关系,将Xpert法检测结果分为高水平、中水平、低水平、极低水平和未检出5个等级, 其中在21例高水平样本中, 培养法检测全部为阳性, 培养报阳时间为16 d, 涂片法阳性14例中, 涂片阳性级别3+～4+者12例(85.71%); 其中在69例极低水平样本中, 培养法检测阳性为51例(阳性率为73.91%), 报阳时间为29 d, 涂片法检测阳性仅有5例(阳性率为7.25%);在Xpert法检测为阴性的314例样本中,发现5例涂片法检测为阳性,培养法检测阳性为5例, 报阳时间为41 d。见表4。

表4 Xpert法与涂片法结果的评价 例(%)

2.4 Xpert法与培养法耐药结果分析 选取Xpert法及培养法检测均阳性的187例菌株进行利福平药敏试验, 药敏结果显示Xper法、培养法对利福平的耐药率分别为22.46%(42/187)和21.92%(41/187),两种方法差异无统计学意义(2=0.167,P>0.05)。以培养法药敏试验为对照标准,Xpert法对利福平耐药的敏感度和特异度分别为95.12%(39/41)和97.95%(143/146),见表5。

表5 Xpert法与培养法耐药结果分析

3 讨论

实验室结核分枝杆菌培养药敏试验是诊断肺结核的金标准,特别是药敏结果对指导临床用药和耐药性监测等方面具有重要作用。由于用药的不规范,产生了耐多药结核分枝杆菌,导致结核病的控制情况比较严峻,需要早诊断、早治疗,早期快速检测对早期合理治疗起到决定性作用,也是耐药结核病防治与控制的重要手段。因此耐多药结核病患者得到早期、及时、合理的诊疗,是有效降低继发性耐药和结核病病死略的重要措施[6]。近年来,快速分子检测技术得到广泛的应用,特别是结核分枝杆菌相关耐药基因快速诊断技术的广泛使用,严峻形势得到了改善。

Xpert法能早期快速检测结核菌和MTB耐药性,2010年WHO推荐其作为活动性结核病及利福平耐药的快速检测技术,特别是对结核发病率高及耐药率高的国家作为结核菌早期快速检测及耐多药结核快速筛查的首选检测方法,为全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链反应系统[7-11],敏感度和特异度分别高达89%和99%,而结核菌素试验只有65%和75%,优势明显。

结核菌的检测除了影像学或病理学检查外,实验室病原学检测结果可作为确诊依据。一方面,当涂片法结果为阳性时,使用Xpert法可以确诊及排除非结核分枝杆菌感染,并能同时检查利福平耐药情况;另一方面,当涂片法结果为阴性、患者有感染症状时,亦能使用Xpert法确诊并能同时提供利福平耐药情况,指导临床诊治。

本研究采用涂片法、培养法和Xpert法对529例患者清晨痰液样本进行检测,Xpert法的敏感度与培养法差异无统计学意义(P>0.05),与涂片法差异有统计学意义(P<0.05)。在涂片法阳性样本中,Xpert法敏感度和特异度与培养法比较差异无统计学意义(P>0.05)。在涂片法检测为阴性样本中,Xpert法与培养法检测结果差异有统计学意义(P<0.05),充分说明Xpert法不仅在涂片法检测阳性的样本中有较好的检出性能,而且在涂片法检测为阴性的样本中,也有较好的敏感度和特异度,检测结果与国内外相关研究结果[12-15]基本上保持一致。

本研究通过Xpert法与涂片法结果的评价,说明Xpert法水平量级程度与样本中MTB菌数呈正比,检测结果等级越高,样本中存在的结核杆菌数量越多,培养法报告阳性的时间越短,与国内外相关研究[13]基本一致。

本研究以Xpert法及培养法检测均为阳性结果的结核杆菌菌株进行利福平药敏试验,药敏结果显示Xper法、培养法检测利福平的耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。以培养法药敏试验为对照标准,Xpert法对利福平耐药的敏感度和特异度与国内外相关研究[16]结果符合。对于Xpert 法报告为极低水平等级及药敏试验显示利福平耐药的样本应采用培养法药敏试验或其他分子生物学手段进一步确认,可以一定程度上避免假阳性的发生。Xpert法检测结核杆菌和利福平耐药性结果的报告时间能够缩短至2 h,可以做到当天采样检测当天报告检测结果,有利于结核病特别是耐药菌株的早期诊断和治疗,具有显著的临床应用价值。

总体而言,培养法是诊断肺结核的金标准,但时效性不够好,涂片法敏感度较低,易出现漏检,均影响结核病的早期诊疗。Xpert法在快速检测和利福平耐药性评价方面敏感度和特异度均较高,临床应用价值显著。

利益相关声明:本文无任何利益冲突。

作者贡献说明:李勰璘、李筱慧负责标本检测;张晓坤负责资料收集、数据统计及分析;论文共同完成。