针药联合对血管性轻度认知障碍大鼠行为学、抗氧化反应及α-Syn的影响 *

欧梦宁 吴明娟 蒙艳丽

（黑龙江省中医药科学院老年病科，黑龙江 哈尔滨 150036）

血管性轻度认知障碍（Vascular mild cognitive impairment，VMCI）是指由血管性因素引起的，或者与血管性因素相关的轻度认知损害综合征，主要临床表现为语言、记忆、认知功能障碍等［1］。VMCI可进一步发展为血管性痴呆［2］。根据症状表现，本病可归为中医学“痴呆”“呆病”“健忘”范畴。研究［3］表明，针刺不仅可以减缓其发展为痴呆的进程，还能改善患者的生活质量。本研究选取针药结合的治疗方法，探索其对VMCI 大鼠认知功能、氧化应激和α-突触核蛋白（α-Syn）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级2 个月龄雄性大鼠，体质量（150±20）g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，动物许可证号：SCXK（黑）2019-001，饲养于黑龙江省中医药科学院实验动物中心。实验前进行为期1 周的适应性喂养，自由进水、饮食。

1.2 主要试剂与仪器总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA 法）（南京建成生物工程研究所）；α-Syn抗体试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；羊抗兔IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；丹参川芎嗪注射液（吉林四长制药有限公司，国药准字H22026448，规格：5 mL）；安迪牌一次性无菌针灸针（贵州安迪医疗设备有限公司，黔械注准20202270002）。

1.3 分组与造模SPF 级大鼠45 只，采用随机数字表法，选出空白组9 只，其余36 只参照文献［4］的方法结扎右侧颈总动脉，建立慢性脑低灌注模型。

大鼠禁食24 h 后手术，以300 mg/kg 剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧固定于固定器上；大鼠颈部备皮，消毒后沿颈正中线切开皮肤，手术镊钝性分离右侧颈总动脉与迷走神经，暴露大鼠右侧颈总动脉，以3-0手术线结扎右侧颈动脉，术后分层关闭手术创口。注意观察大鼠活动情况及保温，放回笼中常规饲养。术后持续4 d 肌肉注射青霉素抗感染（40 000 U/只），密切观察造模大鼠伤口的愈合状况。14 d 后，采用新物体识别实验观察大鼠的认知能力，剔除死亡大鼠及认知能力未受损大鼠共9 只，将模型大鼠随机分为模型组、头穴透刺联合丹参川芎嗪治疗组（简称“针药组”）、丹参川芎嗪治疗组（简称“给药组”），各9只。

1.4 干预方法模型组和空白组无干预措施。

1.4.1 给药组根据Meeh-rubner 体表面积公式计算大鼠用药量［5］后，腹腔注射丹参川芎嗪注射液0.9 mL/kg，每日1次，共3周。

1.4.2 针药组参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”［6］。取穴：四神聪、百会、足三里、神门、太冲。操作：选取0.25 mm×25 mm 一次性毫针（苏州医疗用品厂有限公司，苏械注准20162200970），大鼠用束缚法固定后常规消毒；四神聪上下左右四穴针尖平刺进针，后向百会穴透刺，深度2 mm；直刺双侧足三里，深度7 mm；直刺双侧神门，深度2 mm；直刺双侧太冲穴，深度2 mm；上述穴位均留针30 min，每日1次，持续3周。针刺的时间固定为同一时段且由同一人完成，并予丹参川芎嗪注射液治疗，操作同给药组，共3周。

1.5 取材末次新物体实验结束后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血处死；静置2 h 后离心分离血清，置于-80 ℃冷冻保存备用。取血后，冰盒上迅速取脑并分离双侧海马组织，经预冷的生理盐水冲洗后，分别置于冻存管中，存放于超低温冰箱（-80 ℃）。

1.6 指标检测与方法

1.6.1 新物体识别实验第2 周（干预前）、第5 周（干预后）均进行新物体识别实验［7］，实验装置为不透光的长方形盒子（40 cm×60 cm×80 cm）、2 个相同的物体（A、B）以及不同于物体A（B）的物体C，实验共3 个阶段。适应阶段：第1、2天，将大鼠置于盒内，熟悉该区域10 min。学习阶段：第3 天，将大鼠和两个物体（A、B）一起放于不透明的盒子，使之自由探索5 min，然后将大鼠放回笼子。测试阶段：1 h后，在相同位置将B 换成C，将大鼠放回盒子中，让其探索5 min。每只大鼠探索结束后，区域和物体喷洒酒精祛除气味。

判定标准：以鼻尖、胡须、前肢触碰物体记录为1次，以测试阶段探索物体C所花费的时间（tC）与探索A、C的总时间（t总）比值来分析认知指数（CI），CI=tC/t总。

1.6.2 氧化应激因子收集血液后，转速3000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，取上清，根据试剂盒说明书检测SOD、MDA含量并按照公式算出具体结果。

1.6.3 α-Syn表达蛋白定量后，电泳转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入一抗α-Syn（1∶1000），4 ℃过夜孵育；TBST 缓冲液洗涤3 次后，加入二抗（羊抗兔，1∶5000），封闭4 h；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参，用ECL 发光仪对蛋白成像，灰度值用Image J软件分析。

1.7 统计学方法采用SPSS 25.0 软件统计分析，计量资料以（±s）表示，行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较行LSD 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后CI比较干预前，模型组和两治疗组大鼠CI 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），但较空白组明显下降（P＜0.05）。干预后，与模型组相比，针药组、给药组CI均上升，且针药组CI较给药组高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠干预前后CI比较 （± s，%）

表1 各组大鼠干预前后CI比较 （± s，%）

注：与空白组同时间点比较，1）P＜0.05；与模型组干预后比较，2）P＜0.05；与给药组干预后比较，3）P＜0.05。

干预后0.73±0.51 0.50±0.921）0.57±0.072）0.65±0.062）3）组别空白组模型组给药组针药组鼠数9999干预前0.73±0.51 0.50±0.921）0.47±0.541）0.47±0.321）

2.2 各组大鼠血清SOD活性、MDA含量比较与空白组相比，模型组和两治疗组大鼠血清SOD 活性均下降、MDA 含量均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，给药组、针药组大鼠血清SOD 活性均升高、MDA 含量均降低，且针药组较给药组趋势更明显，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清SOD活性、MDA含量比较（± s）

表2 各组大鼠血清SOD活性、MDA含量比较（± s）

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与给药组比较，3）P＜0.05。

MDA/（nmol/mL）1.17±0.34 3.04±0.341）2.40±0.171）2）1.49±0.281）2）3）组别空白组模型组给药组针药组鼠数9999 SOD/（U/mL）171.69±6.00 114.32±2.381）137.51±6.151）2）145.72±7.141）2）3）

2.3 各组大鼠α-Syn表达情况比较与空白组比较，模型组和两治疗组大鼠α-Syn 相对表达量均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，针药组、给药组α-Syn 相对表达量均降低，且针药组较给药组降低幅度更大，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表3。

图1 各组大鼠α-Syn表达图

表3 各组大鼠α-Syn表达情况比较 （± s）

表3 各组大鼠α-Syn表达情况比较 （± s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05；与给药组比较，3）P＜0.05。

α-Syn表达1.00±0.24 2.22±0.171）1.76±0.111）2）1.40±0.141）2）3）组别空白组模型组给药组针药组鼠数9999

3 讨论

中医认为，痴呆病位主要在脑。《本草纲目》言：“脑为元神之府”。《难经》亦言：“督脉者，起于下极之俞……上至风府，入属于脑”。头针的重要性不言而喻。头部穴位皮肉浅薄，肌肉组织稀少，难以深刺，临床上常用透刺法加强针感传导，达到“一针两穴”的作用。本研究提出头穴透刺联合丹参川芎嗪注射液治疗的方法。针刺选穴从“通督调神”出发，依据“十三五”规划教材［8］中痴呆的主穴，选择四神聪、百会。另根据吴明娟主任的临床经验，选取足三里、神门、太冲穴。中药选择丹参川芎嗪注射液，为丹参素与盐酸川芎嗪的复方中药注射液；丹参素易于吸收，能快速透过血脑屏障，改善神经元存活微环境，降低炎症因子水平［9，10］；川芎嗪可促进细胞内Ca2+释放，且丹参川芎嗪注射液能改善卒中患者神经缺损症状，提高SOD活性［11］。

本研究参照Thong-Asa K 等［4］的研究，用大鼠右侧颈总动脉结扎制作慢性脑低灌注模型，造成轻度认知障碍，并通过新物体识别实验观察大鼠对新奇事物的探索能力，评价其认知功能，同时检测与认知相关因子的变化。研究显示，干预前，模型组和两治疗组大鼠的CI比较，差异无统计学意义，但均较空白组明显下降（P＜0.05），提示大鼠认知功能受损，造模成功。干预后，与模型组比较，两治疗组CI 明显提升，SOD 活性升高，MDA 含量降低，α-Syn 表达减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与给药组比较，针药组CI 提升更为显著，SOD 活性升高和MDA 含量降低的趋势更明显，α-Syn 表达水平更低，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示干预后大鼠认知障碍得到改善，且针药组改善效果优于给药组。

慢性脑低灌注在脑缺血相关认知损伤中十分重要，氧化应激反应是目前的研究热点之一［12］。本研究选取SOD和MDA 作为评价机体氧化应激反应的指标。赖新生等［13］发现血管性痴呆大鼠的记忆障碍得到改善与SOD活性升高、MDA 含量降低有关，这与本实验结果相契合，提示本疗法可能通过改善氧化应激反应来改善大鼠的认知障碍。同时，当大脑慢性低灌注脑缺血造成血管损伤时，相关机制可能为α-Syn 表达增多创造良好的条件，且α-Syn 也会与氧化应激反应相关联［14-16］。有研究［17］表明，α-Syn 可在啮齿类动物脑缺血模型海马区增多。在本实验结果中，模型组和两治疗组大鼠的海马α-Syn 表达确实较空白组增多（P＜0.05），与上述研究结果趋势一致；而治疗后，两治疗组的α-Syn 异常聚集得到纠正，这或许与氧化应激得到缓解有关，但具体的作用机制仍需进一步探索。

慢性脑低灌注损伤会加重机体氧化应激反应，引起α-Syn 异常聚集，导致认知功能损伤。本疗法通过缓解氧化应激反应，降低氧化损伤，抑制α-Syn 过表达，有效改善了VMCI 大鼠的认知功能。值得一提的是，实验结果显示，针药组大鼠的改善效果强于给药组（P＜0.05），这也为临床治疗提供了一个新的思路。