枯草芽孢杆菌和酵母培养物联合添加在断奶仔兔上的应用效果研究

■ 刁 慧 汤文杰 张 晶 严鸿林 晏家友 周梦佳 黄崇波 李书伟

（1.四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066；2.四川省畜科集团有限公司，畜禽生物制品四川省重点实验室，四川 成都 610066；3.重庆市畜牧技术推广总站，重庆 401121；4.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

随着肉兔产业不断发展，肉兔肠炎、腹泻等肠道疾病和鼻炎、肺炎等呼吸道病给肉兔产业造成巨大经济损失[1]。为了追求肉兔的生长速度和生产成绩，高剂量无机微量元素和抗生素被长期添加到肉兔饲料中，但抗生素由于其耐药性也给人们带来了沉重的后果和严峻的考验[2]。我国农业农村部发布的194 号公告规定退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂，这势必会导致养殖业生产水平下降。酵母培养物是由酵母菌在特配的液体培养液和谷物培养基上经过深度发酵而成，终端产品包括变性的培养基、酵母细胞本身和细胞外代谢物等200 多种代谢产物，在机体肠道健康和免疫功能的改善上具有重要的作用[3]。枯草芽孢杆菌能破坏植物细胞的细胞壁，自身能产生维生素、氨基酸、促生长因子等多种容易被利用的物质，通过自身分泌的枯草菌素及产生的孢子来颉颃、竞争性排斥有害病原菌，维持肠道健康[4]。然而，酵母培养物和枯草芽孢杆菌在肉兔上的联合使用未见报道。因此，研究以断奶伊拉肉兔为试验动物，探讨益生菌和酵母培养物对肉兔生长性能、养分消化率、血清免疫、抗氧化和抗应激功能的影响，旨在揭示益生菌和酵母培养物在断奶仔兔上的应用效果，为其在生产上的合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

选用396 只35 日龄、体重为（0.979±0.037） kg 断奶的肉兔，随机分为4 个处理（每个处理11 个重复，每个重复9 只兔），分别为基础饲粮（对照组）、添加1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌、添加3 000 mg/kg 酵母培养物、添加1 000 mg/kg枯草芽孢杆菌+3 000 mg/kg酵母培养物（联合添加组）。试验兔在同一栋封闭式兔舍不锈钢笼子（60 cm×60 cm×45 cm）里饲养，每个笼子3 只兔。预试期7 d，正试期30 d。每天08:00 和17: 00投喂2次饲料。试验期间自由饮水。每日清扫兔舍1次，每隔4 d对兔舍进行喷雾消毒1次。仔兔免疫程序及其他饲养管理按兔场常规进行。

1.2 试验饲粮

试验饲粮参照De Blas 等[5]《兔的营养需要》进行配制，饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

1.3 样品采集

1.3.1 饲料样

饲料样品通过四分法进行采集，每个处理取200 g左右，放入-20 ℃冰箱保存待测养分的含量。

1.3.2 粪样

于试验第27～30 天，采用内源指示剂收粪法，进行消化试验。消化试验共4 d，进行直肠粪样收集。混匀后加入10%硫酸和几滴甲苯固氮防腐，65 ℃烘至恒重，粉碎过40目筛。

1.3.3 血样

试验结束时，每个重复选1 只接近平均体重的肉兔进行耳缘静脉采血3 mL，4 ℃冰箱中静置12 h，4 000 r/min离心10 min，分离出血清，-20 ℃保存待用。

1.4 测定指标

1.4.1 生长性能

试验第0 天、第15 天和第30 天末，分别对每只兔进行空腹称重。试验期内，以重复为单位，记录总投料量和总剩料量。根据ADG和投料量计算F/G。

1.4.2 养分表观消化率

参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[6]测定CP、干物质（DM）、粗脂肪（EE）和CF，采用内源指示剂法（AIA 法）计算肉兔饲粮养分表观消化率。内源指示剂盐酸不溶灰分的测定方法参见GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》。

1.4.3 血清抗氧化指标

用南京建成生物工程研究所有限公司生产的试剂盒，结合紫外光分光光度计（UV-1100，上海美普达）测定血清中抗氧化相关指标，包括丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。

1.4.4 血清免疫指标

用南京建成生物工程研究所有限公司生产的试剂盒，结合紫外光分光光度计测定血清中K、Na 和溶菌酶含量。血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素-10（IL-10）含量采用ELISA 试剂盒测定，测定试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司，操作均按说明书进行。

1.4.5 血清抗应激指标

血清醛固酮、皮质醇和热休克蛋白70（Hsp70）含量采用ELISA 试剂盒测定，测定试剂盒购自北京诚林生物科技有限公司，操作均按说明书进行。

1.5 统计分析

所有数据均用Excel 2010 进行初步整理，采用SAS 8.0中的one-way ANOVA检验对数据进行统计分析，以P＜0.05作为差异显著，0.05≤P＜0.10视为有趋势。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对肉兔生长性能的影响

由表2可知，与对照组相比，饲粮添加3 000 mg/kg酵母培养物显著提高断奶仔兔1～15 d ADG，降低F/G，提高饲料转化率（P＜0.05）。联合添加组断奶仔兔16～30 d ADG 显著高于对照组，F/G 显著低于对照组（P＜0.05）。从全期来看，枯草芽孢杆菌和酵母培养物联合添加有提高断奶仔兔ADG、降低F/G 的趋势（P＜0.10）。

表2 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对断奶肉兔生长性能的影响

2.2 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对肉兔养分表观消化率的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮添加3 000 mg/kg酵母培养物或与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌联用，显著提高断奶仔兔DM 和EE的表观消化率（P＜0.05）；联合添加组断奶仔兔CF 的表观消化率显著提高（P＜0.05）；各处理组均可提高断奶仔兔CP 的表观消化率（P＜0.05）。

表3 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对断奶肉兔养分消化率的影响(%)

2.3 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对肉兔免疫指标的影响

由表4 可知，与对照组相比，3 个处理组均可提高断奶仔兔血清IgA 和IgG 的含量（P＜0.05）；饲粮添加3 000 mg/kg 酵母培养物或与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌联用，显著提高断奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量（P＜0.05）。联合添加组断奶仔兔血清IgA和IgM的含量显著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌组和3 000 mg/kg酵母培养物组（P＜0.05）。联合添加组断奶仔兔血清IFN-γ的含量显著高于1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌组（P＜0.05）。与其他几组相比，联合添加组断奶仔兔血清溶菌酶含量显著提高（P＜0.05）。

表4 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对断奶肉兔血清免疫指标的影响

2.4 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对肉兔抗氧化能力的影响

由表5 可知，与对照组相比，3 个处理组均可降低断奶仔兔血清MDA 的含量（P＜0.05）；饲粮添加3 000 mg/kg 酵母培养物或与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌联用均可提高断奶仔兔血清T-AOC（P＜0.05）；联合添加组断奶仔兔血清SOD 活性显著提高（P＜0.05）。

2.5 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对肉兔抗应激能力的影响

由表6 可知，与对照组相比，3 个处理组均可提高断奶仔兔血清Hsp70 的含量（P＜0.05）；饲粮添加3 000 mg/kg酵母培养物或与1 000 mg/kg枯草芽孢杆菌联用，均可降低断奶仔兔血清醛固酮和皮质醇的含量以及K/Na 比值（P＜0.05）。与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌组相比，联合添加组断奶仔兔血清醛固酮水平显著降低（P＜0.05）。

表6 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对断奶肉兔抗应激能力的影响

3 讨论

研究证实，幼龄动物消化系统在断奶时发育并不完善，肠道微生物群落发育也不成熟，在断奶后7～10 d 才会逐步建立适应固体饲料消化的正常微生物菌落[7]。因此，肉兔断奶后添加酵母培养物和枯草芽孢杆菌可以帮助机体快速形成平衡的微生物菌落，改善营养物质消化，促进生长。已有大量试验表明，酵母培养物对提高猪、鸡、鹅、牛、羊的生产性能具有良好的效果，但在肉兔上的研究非常有限。酵母培养物富含酶、氨基酸、有机酸、活性小肽、甘露寡糖、未知生长因子等，进入胃肠道后促进肉兔肠道发育，减少断奶对肉兔带来的应激，从而提高生长性能。唐丽等[8]研究发现，日粮中添加0.1%、0.2%和0.3%的酵母培养物可显著降低肉兔腹泻率，添加0.2%和0.3%酵母培养物组拥有更高浓度的血清葡萄糖，有利于保证机体能量供给，维持正常生理功能，提高生长性能。Celaire 等[9]研究发现，饲粮中添加产植酸酶活性酵母培养物提高肉兔ADG，改善生长性能，提示酵母培养物是一种高效的兔用饲料添加剂。作为饲料中常用的益生菌种之一，枯草芽孢杆菌对改善畜禽生长性能具有正向效果。Guo等[10]比较不同水平枯草芽孢杆菌（105、106CFU/g 和107CFU/g）对肉兔生长性能的影响，结果发现，断奶仔兔饲粮中添加106CFU/g 枯草芽孢杆菌组具有最佳的ADG。张灿[11]在獭兔上的研究得到了类似的结果。此外，枯草芽孢杆菌和其他的益生菌（乳酸杆菌、兔源脆弱拟杆菌）[4,12]或功能性添加剂（果寡糖、酸化剂、酶制剂等）[13]联用进一步提高肉兔ADG，改善饲料转化率。本试验研究发现，饲粮单独添加3 000 mg/kg 酵母培养物显著提高断奶仔兔1～15 d ADG、降低F/G；与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌联用显著提高断奶仔兔16～30 d ADG、降低F/G。关于酵母培养物和枯草芽孢杆菌提高生长性能的原因，有研究者认为与其增加肠道微生物多样性、改善肠道屏障功能和提高养分消化率有关[4,14]。

肉兔在断奶时极易造成肠道功能紊乱，导致养分消化率降低，产生腹泻。在本试验中，饲粮添加3 000 mg/kg酵母培养物或与1 000 mg/kg枯草芽孢杆菌联用，显著提高断奶仔兔CP、DM 和EE 的表观消化率，这与前人在酵母培养物或枯草芽孢杆菌上的研究结果一致。饲粮添加2%酵母培养物显著提高獭兔CF、CP 和DM 的表观消化率，饲粮添加3%酵母培养物显著提高獭兔钙的表观消化率[15]。肉兔盲肠发达，微生物丰富，酵母培养物丰富的营养物质为盲肠中的微生物提供营养，从而提高饲料的消化率。饲粮添加100、200 mg/kg 或300 mg/kg 枯草芽孢杆菌均显著提高獭兔总钙和酸性洗涤纤维的表观消化率，饲粮添加200 mg/kg 枯草芽孢杆菌显著提高獭兔中性洗涤纤维的表观消化率[11]。0.5×106CFU/g枯草芽孢杆菌和0.5×107CFU/g乳酸杆菌联用提高断奶仔兔DM、CP、中性洗涤纤维、有机质和总能的表观消化率[4]。消化酶活性的高低和肠道形态结构的完整性是反映机体消化能力强弱的重要标志。枯草芽孢杆菌的添加或灌服显著提高肉兔空肠淀粉酶和蛋白酶活性[16]，促进小肠黏膜细胞的增殖，提高十二指肠绒毛高度和隐窝深度比值，增大小肠吸收面积，可维持小肠上皮的正常结构，因而增强了机体对营养物质的吸收功能[12]。因此，酵母培养物和枯草芽孢杆菌可通过提高肉兔肠道消化酶活性，改善肠道形态结构，进而提高养分消化率。

氧化应激是指活性氧的产生与机体抗氧化防御能力之间的不平衡。对于幼龄动物来说，断奶和感染可导致氧化应激，给细胞抗氧化防御系统带来巨大的损害[17]。酵母培养物，由酿酒酵母经过深度发酵而成，终端产品包括200 多种代谢产物，具有抗氧化的功能[3]。本研究中发现，饲粮添加3 000 mg/kg酵母培养物和/或1 000 mg/kg枯草芽孢杆菌显著降低血清MDA的含量，说明酵母培养物和枯草芽孢杆菌均具有降低脂质过氧化程度、降低细胞损伤的功能。机体清除自由基的能力与酶促和非酶抗氧化防御系统有关，SOD、CAT 和GSH-Px是体内具有代表性的酶性抗氧化物质，通过减少H2O2的积累对有毒化合物和氧自由基作出反应，TAOC 参与非酶抗氧化防御系统[18]。本研究中发现，饲粮单独添加3 000 mg/kg酵母培养物，可提高断奶仔兔血清T-AOC的含量，枯草芽孢杆菌和酵母培养物同时添加显著提高断奶仔兔血清SOD活性。本研究结果与谢开春[19]在肉兔上的研究结果一致，饲料中添加0.3%或0.6%枯草芽孢杆菌能显著增加血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC，降低MDA 含量。由此说明，枯草芽孢杆菌和酵母培养物可以保护断奶仔兔免受氧化应激的影响，具有维持抗氧化防御系统的功能。

断奶应激除了引起机体产生氧化应激外，也会引起以促炎因子炎症含量提高为标志的免疫反应[20]。体液免疫是动物机体特异性免疫的重要组成部分，抗体对毒素的中和作用和免疫调理吞噬作用都与免疫球蛋白的水平有关，淋巴细胞产生的免疫球蛋白在血清中的含量可以直接反映机体体液免疫状态[21]。本研究中发现，枯草芽孢杆菌和酵母培养物单独或联合使用均可提高断奶仔兔血清IgA、IgG 和溶菌酶的含量，酵母培养物单独添加或与枯草芽孢杆菌联用显著提高断奶仔兔血清IgM 和IFN-γ的含量，这与前人在獭兔或肉兔上单独添加酵母培养物或枯草芽孢杆菌的研究结果一致。饲粮添加2%酵母培养物显著提高獭兔血清IgA 与IgM 的含量，饲粮添加3.0%酵母培养物可以显著提高血清中IgA 与IgG 的含量[15]。酵母培养物中含有丰富的作为抗原活性物质的细胞壁免疫多糖，通过与病原菌的代谢产物作用竞争性抑制其在肠道内活动，降低病原性微生物在肠黏膜的附着能力，同时活化多种免疫细胞，提高抗体含量，发挥免疫调节作用[22]。研究发现，肠道微生物对宿主的体液免疫和细胞免疫均有一定的调节作用，如诱导CD4+细胞的增殖，调节树突状细胞，影响肠黏膜Th 细胞因子的分泌，激活自然杀伤细胞[23-24]。新西兰大白兔饲喂106CFU/g 枯草芽孢杆菌显著提高血清中免疫球蛋白IgG 和IgA 的含量，增加胸腺和脾脏相对重量，提高盲肠菌群的物种多样性，上调脾脏和空肠模式识别受体核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1（NOD1）、NOD 样受体家族 CARD 结构域 3（NLRC3）、富含亮氨酸重复序列的家族蛋白X1（NLRX1）表达量和下游的白介素1β（IL-1β）、白介素8（IL-8）和IFN-γ以及β防御素表达量，说明枯草芽孢杆菌可以通过激活NOD1诱导下游β防御素的表达从而提高机体抗病力[25]。饲粮添加300、400 mg/kg复合芽孢杆菌制剂，均能提高肉兔肠黏膜分泌型IgA含量、血清IgM、补体3、补体4的含量，降低肉兔盲肠大肠杆菌和总好氧菌数量，显著增加乳酸杆菌、双歧杆菌和总厌氧菌数量[26]。因此，从前面提到的所有证据来看，酵母培养物和枯草芽孢杆菌可通过调节细胞因子和抗体的产生诱导仔兔免疫应答。

皮质醇是一种糖皮质激素，能够抑制机体生长和免疫功能，参与机体糖代谢和热调节，其水平是衡量动物应激程度和生理机能变化的重要指标之一[27]。应激会激活下丘脑垂体肾上腺皮质轴，引起体内皮质醇水平升高，是抑制免疫细胞、导致动物机体免疫功能下降的主要因素[28]。醛固酮是一种盐皮质激素，具有调节体内Na/K 平衡的功能，在维持机体内环境稳定中起着重要作用[29]。脑脊液和血浆中血管紧张素Ⅱ的含量在机体处于应激状态下增高，促使醛固酮分泌增加，引起血管收缩，水钠潴留，Na/K 上升，进一步加重血液动力的障碍[30]。肉鸡上的研究发现，热应激添加益生菌制剂显著降低血清中皮质醇的含量，改善生长性能[31]。猪上的研究发现，在高温高湿的状态下，添加酵母培养物在一定程度上降低血清中的皮质醇浓度，改善长期热应激导致的机体免疫功能下降[32]。奶牛上的研究发现，饲喂产甘油酵母培养物使血清皮质醇含量降低15.71%。本研究发现，饲粮添加酵母培养物或与枯草芽孢杆菌联用显著降低断奶仔兔血清中醛固酮和皮质醇的含量以及K/Na 比值，这说明补充酵母培养物和枯草芽孢杆菌后改善了仔兔受应激的状态。Hsp70 的表达与机体遭受热应激刺激密切相关，能够提高机体的抗应激能力[33]。研究发现，夏季动物血液淋巴细胞Hsp70 表达量显著高于其他季节[34]。汤志宏等[35]研究发现，饲粮添加酵母培养物或复合益生菌显著提高了热应激奶牛42 d 血清中三碘甲腺原氨酸浓度，42 d 血清Hsp70 的含量分别提高了19.20%和23.46%，说明酵母培养物和益生菌可以通过提高血清Hsp70 浓度来增强奶牛抗应激能力。本试验是在夏季7 月高温进行，酵母培养物或枯草芽孢杆菌的添加显著提高仔兔血清中Hsp70 浓度，提示补充酵母培养物或枯草芽孢杆菌可缓解仔兔遭受高温应激带来的负面影响。

4 结论

综上，饲粮添加3 000 mg/kg 酵母培养物或与1 000 mg/kg 枯草芽孢杆菌联用，可提高断奶仔兔DM、CP 和EE 的表观消化率；降低血清MDA 的含量，增加血清T-AOC，提高断奶仔兔抗氧化能力；增加血清中IgA、IgG、IgM 和IFN-γ的含量，改善断奶仔兔免疫力；降低血清醛固酮、皮质醇的含量，增加血清Hsp70 的含量，提高断奶仔兔抗应激能力，最终改善生长性能。