卵巢高级别浆液性癌驱动基因相关的临床病理研究进展

甘文婷,张智弘,王 聪

卵巢癌是女性生殖系统病死率最高的恶性肿瘤,卵巢高级别浆液性癌(high grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)是卵巢癌的主要类型[1]。HGSOC有多种基因变异,显著特征是驱动突变和体细胞拷贝数变异,具有不同基因变异的HGSOC病理特征和临床表现存在差异。最新的癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据库显示96%的HGSOC患者存在TP53基因突变;乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene, BRCA)1和2胚系突变率分别为9%、8%,体系突变率约为3%;约20%具有CCNE1基因扩增。另外,PTEN、RB1、NF1和MYC等基因变异也占据一定比例[2]。目前,错配修复(mismatch repair, MMR)缺陷/微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)在妇科肿瘤中也逐渐获得关注[3]。本文对上述基因在HGSOC中变异特点、检测方法和相关治疗的研究进展进行综述,为HGSOC的预测、诊断和靶向药物的研究提供理论依据。

1 TP53突变及免疫组化判读

抑癌基因TP53基因编码的p53蛋白属于转录因子,介导多种信号转导途径,对细胞正常的活动进行调控。当细胞遭遇DNA损伤、缺氧、营养不足或原癌基因激活等刺激时,p53蛋白水平升高,作用于不同的靶基因,引起细胞周期阻滞、凋亡、DNA修复、衰老和铁死亡等,抑制细胞增殖和实现抑癌作用[4]。正常输卵管上皮分泌细胞核过表达p53蛋白,是HGSOC发生的最早期事件。TP53突变在HGSOC和前驱病变即浆液性输卵管上皮内癌(serous tubal intraepithelial carcinoma, STIC)中的特征一致[1,5]。

在病理诊断中,TP53突变可作为HGSOC的判断依据,TP53突变检测的主要方法是免疫组化染色和下一代基因测序(next-generation sequencing, NGS)。Park等[6]的研究显示免疫组化染色与NGS检测结果的一致性达92.6%,提示p53免疫组化染色是反映TP53突变较为可靠的指标。“正常”或“野生型”呈强弱不等的核表达;“异常”或“突变型”表达则有3种模式,包括核过表达、完全缺失和胞质表达。p53核过表达模式表现为HGSOC固定良好区域细胞核弥漫强染色;完全缺失模式中肿瘤细胞均无染色,且内对照细胞(间质细胞和淋巴细胞)呈正常表达;胞质表达模式呈胞质中等或强染色,同时核不表达或正常表达;染色模式中核弥漫强表达与错义突变相关,均不表达的染色模式常提示无义突变或移码突变,野生型呈强弱不等的异质性表达;基于突变型的表达模式,常可通过p53免疫组化表达突变型辅助诊断HGSOC[7]。胞质表达模式与p53完全缺失或细胞核p53强表达患者相比,其预后可能较差[8]。

目前,免疫组化染色与NGS结果不一致的现象仍然存在,原因可能包括突变密码子分析的局限性、样本偏倚、肿瘤异质性和细胞应激延迟p53降解等[6-7]。

TP53是药物研究的靶点,研究方向主要是恢复TP53的抑癌功能,如APR-246将突变的TP53恢复成野生型结构。目前,TP53突变靶向药物研究依然有限[9]。

2 BRCA1/2致病机制、检测方法与靶向药物

有关家族性乳腺癌的遗传学研究显示:BRCA1和BRCA2也是卵巢癌尤其是HGSOC的风险因素,70岁卵巢癌BRCA1携带者的累积患病风险高达44%,而BRCA2携带者则为27%[10]。约25%的HGSOC有BRCA1/2的胚系或体细胞突变,BRCA1/2突变导致同源重组缺陷(homologous recombination deficiency, HRD),其作用机制是不同程度的DNA损伤有不同修复方式,其中双链断裂(double strand breaks, DSB)修复易出现问题。DSB修复主要有同源重组修复(homologous recombination repair, HRR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)。当BRCA1/2突变时,断裂的双链无法通过HRR修复,此时由NHEJ进行修复。NHEJ修复中DNA连接酶直接作用于断裂点连接核苷酸,不依赖模板易出现核苷酸的插入或缺失,导致基因组不稳定,进而发生肿瘤[11]。

BRCA1/2缺陷患者对PARP抑制剂的敏感性高,PARP抑制剂通过抑制PARP1使碱基切除修复无法行使其功能,从而阻断细胞单链损伤修复[11]。在BRCA1/2缺陷的肿瘤细胞中使用PARP抑制剂,细胞的单链损伤修复缺陷和HRR缺陷同时存在,细胞复制过程中产生的DSB无法修复,出现合成致死效应,最终导致细胞死亡[12]。目前,国内外已有多种PARP抑制剂获批用于卵巢癌的临床治疗。临床试验证实PARP抑制剂可有效延长BRCA1/2突变HGSOC患者的中位无进展生存期[13]。

采用NGS检测明确BRCA1/2是胚系突变还是体细胞突变;检测样本为新鲜组织或福尔马林固定石蜡包埋穿刺/手术标本,初步检测突变阳性者可进一步行胚系检测(如血液、口腔拭子等)[14]。HGSOC检测样本除穿刺/手术样本外,还有腹水或胸水等细胞样本[14]。NGS可检测BRCA1/2基因点突变和小片段插入/缺失,部分经过特殊设计的NGS方法还可检测大片段重排(large genomic rearrangement, LGR)。同时,NGS检测BRCA1/2也存在缺陷,如对检测样本要求高,检测LGR时易发生漏诊,检测方法和结果解读缺乏标准化等[15]。另外,Sanger检测是BRCA1/2点突变和小片段插入/缺失的金标准,可验证NGS检测结果。多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification assay, MLPA)常用于BRCA1/2基因的LGR检测[15]。

BRCA1/2检测的重要意义:(1)通过BRCA1/2突变筛选对铂类药物和PARP抑制剂敏感的HGSOC患者;(2)对未患病但携带BRCA1/2突变者,推荐阴道超声和CA125检查进行长期监测,必要时进行降低风险的预防性输卵管-卵巢切除术(risk-reduced salpingo-oophorectomy, RRSO);(3)对BRCA1/2胚系突变者,建议其亲属也进行BRCA1/2基因检测,明确其是否存在发病风险,对突变者随访观察,必要时推荐行RRSO[16]。

3 CCNE1的致病机制、预后影响及检测方法

CCNE1扩增和非扩增的HGSOC具有不同的病理、生物学特征和临床结果,提示CCNE1扩增HGSOC是一个独立亚群[17]。CCNE1编码Cyclin E1,Cyclin E1结合并激活CDK2,促进细胞周期由G1期到S期转换。当CCNE1扩增时,Cyclin E1水平升高,G1期到S期的转换加快,细胞周期紊乱,出现基因组不稳定性,导致肿瘤形成[17]。

值得注意的是,Cyclin E1水平升高并不只是CCNE1扩增的结果,Cyclin E1蛋白质稳定和缺乏降解也可导致Cyclin E1升高[18]。CCNE1扩增和高表达均是HGSOC的不良预后因子,由于CCNE1扩增和HRD几乎不同时发生,当HGSOC存在CCNE1扩增时,HRR处于活跃状态,对化疗药物产生耐药且对PARP抑制剂反应低[13,19-20],提示CCNE1扩增可能是部分非HRD的HGSOC药物研究的靶点。

目前,CCNE1扩增有多种检测方法:(1)免疫组化可检测CCNE1蛋白表达,但不能反映CCNE1扩增[18,20]。(2)FISH可观察CCNE1扩增情况,并计算基因拷贝数[20]。(3)显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization,CISH)融合免疫组化和FISH的特点,可检测CCNE1扩增[20]。(4)qRT-PCR对CCNE1扩增进行定量分析[21]。

随着药物的不断研发,CCNE1作为药物治疗靶点,单一或联合应用CDK2和WEE1等抑制剂是治疗的新方向[17,20],CCNE1扩增在HGSOC中的作用将会得到更多重视。

4 PTEN变异的致病机制与临床病理特征

PTEN是常见的抑癌基因,其表达产物抑制PI3K/AKT信号通路,从而调控细胞增殖、迁移、基因组稳定和代谢。当PTEN突变或失活时,其功能出现异常,失去抑制肿瘤增殖和生长的功能[22]。

PTEN表达缺失可见于STIC中, 推测PTEN功能缺失是HGSOC的早期事件[22]。TCGA数据显示,约7%的HGSOC存在PTEN缺失或突变[2],文献报道20%～40%的HGSOC中PTEN表达缺失[22-24]。Zhang等[23]报道表观遗传沉默或转录后修饰可能在PTEN表达中发挥主要作用,PTEN缺陷可能引起RAD51下调,形成HRD表型。虽然前列腺癌、子宫内膜样癌的PTEN表达缺失患者对PARP抑制剂敏感性较高,但HGSOC的PTEN表达缺失患者对PARP抑制剂反应不佳[6,24]。另外,PTEN表达缺失的HGSOC患者ER表达下调,表现为化疗耐药,预后较差,PTEN缺失与CCNE1扩增互斥[22-23]。根据以上特征,考虑将PTEN表达缺失作为HGSOC的一个亚组。

免疫组化是PTEN表达缺失的主要检测方法,PTEN可呈异质性表达,暂无统一的判读标准。NGS可检测PTEN基因是否存在突变或缺失,可作为免疫组化法评估肿瘤PTEN状态的补充[23-24]。PTEN与相关PI3K/AKT信号通路可作为治疗药物研究的方向,对标准治疗无效的晚期卵巢癌患者可从PI3K抑制剂中获益[25]。

5 RB1的致病机制与临床病理特征

抑癌基因RB1编码Rb蛋白,Rb蛋白结合E2F转录因子,阻滞细胞周期进展。当RB1突变或失活时,对细胞周期的阻滞作用减弱,细胞增生失控导致肿瘤的发生[26]。在HGSOC病例中,RB1基因缺失、突变分别占比8%、2%,两者均可导致Rb蛋白表达缺失[2]。

RB1表达缺失与患者生存期有关,一项纳入铂类化疗HGSOC病例的研究发现,无进展生存期和总生存期长的HGSOC患者中RB1表达缺失频率更高,且RB1信使RNA水平越低,患者总生存期越长[27]。另外,RB1表达缺失常出现在不宜手术且无进展生存期长的患者中,表明RB1表达缺失患者的化疗敏感性可能更高;RB1表达缺失并同时有HRD的患者生存期更长,提示RB1在HRR中可能发挥作用[27]。目前,免疫组化是RB1的主要检测方法,反映Rb蛋白在组织中的表达;也可用NGS对RB1基因突变、甲基化等进行检测[2,27]。RB1表达缺失患者对化疗有较高敏感性,应积极进行以铂类药物的化疗方案。另外,RB1可作为HGSOC的治疗靶点,如CDK4/6抑制剂可降低E2F表达,触发抗肿瘤免疫,可能为RB1表达缺失患者提供治疗疗效[28]。

6 NF1失活的致病机制与靶向药物研发

NF1基因属于抑癌基因,编码神经纤维瘤蛋白,调节细胞内活化RAS蛋白水平,NF1突变或缺失可导致神经纤维瘤蛋白功能缺失,细胞内活化RAS蛋白维持在一定水平,RAS/RAF/MEK/ERK信号通路和PI3K/AKT信号通路持续激活,最终导致细胞过度增殖和肿瘤形成[29]。

约12%的HGSOC病例存在NF1功能缺失,NF1失活与CCNE1高水平扩增互斥,同时发生RB1丢失,在BRCA1/2突变与野生型HGSOC中的发生频率相似。NF1失活HGSOC患者的生存期介于BRCA1/2突变(预后佳)和CCNE1高水平扩增(预后差)的HGSOC之间[2,30]。在NF1相关的治疗研究中,RAS/RAF/MEK/ERK信号通路相关靶点可作为治疗药物开发的主要靶标,如MEK抑制剂司鲁美替尼可逆转HGSOC的抗雌激素耐药[30]。体外实验表明,BET抑制剂可拮抗有NF1缺陷的HGSOC患者对曲美替尼的耐药性,BET抑制剂有望成为NF1突变HGSOC患者治疗的新方向[31]。NGS是检测NF1基因是否出现变异的重要方法[32]。最近有研究通过免疫组化检测NF1缺失,发现17.4%HGSOC中检测到NF1表达缺失,其中11%为亚克隆缺失[33]。

7 MYC扩增的致病机制与靶向药物研发

核蛋白类癌基因MYC在>20%的HGSOC中存在扩增[2,34],编码产物c-MYC是作用广泛的转录因子,与MAX形成同源二聚体,并与E-box上的启动子区域结合,调控与细胞生长和增殖有关的基因转录,当MYC发生扩增或染色体易位时MYC调控失常,导致肿瘤的发生和发展[34]。

MYC扩增对HGSOC预后的影响仍未明确[34],应用免疫组化检测可初步判断MYC是否存在过表达,采用DNA杂交、FISH和NGS等检测MYC是否扩增[35]。以MYC为靶点治疗HGSOC的药物已取得一定进展,如JQ1(BET抑制剂)抑制MYC基因转录的上游BRD4蛋白,从而抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡[34]。

8 MMR基因突变的致病机制和免疫治疗

MMR是DNA修复机制之一,可移除DNA复制过程中整合错误的核苷酸,防止子代细胞出现基因突变。当MMR基因突变或功能缺失时,微卫星序列/简单重复序列的复制错误无法被MMR修复,导致MSI并诱导肿瘤发生[3]。0.4%～2.6%的HGSOC中出现错配修复缺陷(mismatch repair deficiency, dMMR)/MSI[36-38]。MMR基因突变包括体系和胚系突变,其中胚系突变与Lynch综合征有关[38]。目前还缺少HGSOC的dMMR/MSI独立的队列研究。

dMMR/MSI检测有3种方法:(1)免疫组化是主要的检测方法,当4种MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)均呈核阳性时,判读为错配修复功能正常(mismatch repair deficiency proficiency, pMMR),当至少1种蛋白表达缺失时则为dMMR[39]。(2)PCR检测微卫星位点,结果有微卫星高度不稳定、低度不稳定和微卫星稳定[39]。然而,不同类型肿瘤的MSI检出率受检测位点的影响,目前尚缺乏关于HGSOC特异MSI位点的研究[36,40]。(3)NGS检测可提供MMR基因胚系突变、肿瘤突变负荷等多种信息,但结果缺乏统一的解读标准[41]。

dMMR/MSI肿瘤对免疫检查点抑制剂敏感性较高,免疫检查点抑制剂如PD-1/PD-L1抑制剂等可延长多种肿瘤患者的总生存期[3,38]。然而,关于dMMR/MSI的HGSOC免疫治疗报道较少[42]。鉴于以往研究中免疫检查点抑制剂对HGSOC患者疗效较小,dMMR/MSI检测可能成为指导免疫检查点抑制剂用药的依据[43]。

9 小结

HGSOC是多种基因变异导致的肿瘤,除上述基因变异外,其他基因如CDKN2A、PAX8、WT-1、AKT2和RAD51C/D等均与HGSOC的致病机制有关。分析上述基因变异与肿瘤组织学特征、临床表现、化疗的敏感性和预后的关系,有助于建立HGSOC遗传学变异框架,更好地进行疾病的预测、诊断和靶向药物的研究。