子宫内膜样癌中KIFC1的表达及临床意义

邓 涛,温媛媛,何 慧,钱立勇

中心体聚集扩增可引起染色体不稳定和细胞周期失调,进而导致癌症发展和转移。这种扩增现象仅发生在癌细胞中,作为特殊癌细胞靶向治疗已引起学者们广泛关注[1]。中心体聚集涉及多种蛋白,与其关系密切,对多余中心体的聚集至关重要,可使伪双极纺锤体形成,驱动染色体错误分离形成非整倍体,促使致癌作用的启动和(或)加速[2]。研究表明,KIFC1在前列腺癌、肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌和胃癌中高表达,与不良预后有关[3-9]。KIFC1在多种肿瘤中表达上调,并调节致癌信号级联,是潜在的肿瘤特异性治疗靶点。目前,文献报道KIFC1在子宫内膜样癌中的表达和作用较少。本文旨在探讨KIFC1在子宫内膜样癌中的表达和临床意义,分析其与预后的关系,为子宫内膜样癌的靶向治疗和预后评估提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2012年1月～2022年12月我院病理科确诊的子宫内膜样癌组织95例,癌旁正常子宫内膜组织30例,均未接受药物和放化疗等相关治疗。根据WHO女性生殖肿瘤分类标准和FIGO分期系统明确诊断,其中子宫内膜样癌患者平均年龄55.27岁,另检索TCGA数据库中子宫内膜样癌540例(http://www.oncolnc.org)进行验证分析。本实验经我院伦理委员会审核批准,患者均知情同意。

1.2 主要试剂兔抗人KIFC1单克隆抗体购自美国Abcam公司,SP试剂盒、DAB显色剂和β-actin抗体均购自北京中杉金桥公司,PCR引物购自上海生工公司,FastQuant RT Kit试剂盒购自北京天根生化公司,GO Taq qPCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司。

1.3 方法

1.3.1免疫组化法 标本均经10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,4 μm厚切片,常规烤片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水,柠檬酸修复液高温高压抗原修复2 min。免疫组化采用SP法染色,观察KIFC1在子宫内膜样癌和癌旁子宫内膜组织中的表达。每张切片随机选取5个高倍视野,每个视野计数200个细胞,根据细胞着色强度和阳性细胞百分比进行评分。(1)按细胞着色强度评分:无着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比评分:无阳性细胞为0分,≤10%为1分,11%～50%为2分,51%～80%为3分,>80%为4分。两项得分相乘:≥3分为阳性,<3分为阴性。

1.3.2qRT-PCR检测 本实验提取30对子宫内膜样癌和癌旁正常子宫内膜组织总RNA,利用FastQuant RT Kit试剂盒反转录获得cDNA,应用GO Taq qPCR Master Mix试剂盒在ABI 7500上进行qRT-PCR分析。实验至少重复3次,结果取平均值。KIFC1上游引物:5’-GACGCCCTGCTTCATCTG-3’,下游引物:5’-CCAGGTCCACAAGACTGAGG-3’;内参18S上游引物:5’-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3’;下游引物:5’-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3’。

1.3.3Western blot检测 将30对新鲜子宫内膜样癌组织和对应的癌旁正常子宫内膜组织剪碎、匀浆、加入裂解液充分裂解,离心(4 ℃、15 000 r/min、30 min),提取上清为总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度,每孔上样量为80 μg,聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳、转印、脱脂奶粉封闭2 h,KIFC1一抗(稀释比为1 ∶800)4 ℃孵育过夜,第2天洗膜后37 ℃孵育二抗2 h,ECL发光。结果经自动凝胶成像分析仪采集,β-actin做内参,对目的蛋白进行灰度值比值测定。每组结果相同条件至少重复3次,取平均值。

1.4 随访患者采用门诊复查和电话随访,平均每6个月随访1次。随访截至2022年12月31日,或以患者死亡时间为止,删失者均纳入生存分析。

2 结果

2.1 子宫内膜组织中KIFC1蛋白的表达KIFC1蛋白在癌旁正常子宫内膜组织中的阳性率为13.33%(4/30),在子宫内膜样癌中的阳性率为61.05%(58/95),两者差异有统计学意义(χ2=20.769,P<0.001,图1)。选取的95例子宫内膜样癌中,高分化52例,中低分化癌43例,<1/2肌层浸润64例,≥1/2肌层浸润31例,FIGO I+Ⅱ期72例,Ⅲ+Ⅳ期23例,伴淋巴结转移17例,不伴淋巴结转移78例。统计分析发现KIFC1表达与子宫内膜样癌肌层浸润深度、FIGO分期和淋巴结转移均密切相关(P均<0.05),与患者年龄和组织学分化程度均无关(P均>0.05,表1)。

表1 子宫内膜样癌组织中KIFC1表达与临床病理特征的关系

AB

2.2 子宫内膜组织中KIFC1的表达量qRT-PCR结果显示,在癌旁正常子宫内膜组织和子宫内膜样癌中KIFC1 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.29和2.99±0.59,差异有统计学意义(t=16.476,P<0.001,图2A)。TCGA数据库分析发现,KIFC1 mRNA在540例子宫内膜样癌中高表达(P<0.001,图2B),与本组PCR检测结果一致。

图2 子宫内膜样癌和癌旁正常子宫内膜组织中KIFC1 mRNA和蛋白表达：A.qRT-PCR法检测KIFC1 mRNA的表达,*P<0.001;B.TCGA数据库比较子宫内膜样癌组织与癌旁正常子宫内膜组织中KIFC1 mRNA的表达量,*P<0.001;C.Western blot法检测KIFC1蛋白表达;C1、C2、C3. 子宫内膜样癌组织;N1、N2、N3. 癌旁正常子宫内膜组织

Western blot结果显示,KIFC1蛋白在癌旁正常子宫内膜组织和子宫内膜样癌中相对表达量分别为0.72±0.17和1.70±0.36,差异有统计学意义(t=13.354,P<0.001,图2C)。

2.3 生存分析本组生存分析显示,KIFC1阳性患者中位生存时间为93个月;KIFC1阴性患者中位生存时间为120个月。KIFC1阳性患者生存时间与OS显著低于阴性患者,差异有统计学意义(χ2=7.012,P=0.008,表2,图3A)。本组结果显示:KIFC1蛋白表达、FIGO分期和淋巴结转移与患者的生存时间相关(P均<0.05,表2),Cox回归分析结果表明KIFC1是子宫内膜样癌患者预后的危险因素(P=0.045,表3)。本组与TCGA数据库中540例子宫内膜样癌组织生存分析结果一致(χ2=5.398,P=0.020,图3B)。

表2 子宫内膜样癌患者OS的Logrank回归分析

表3 子宫内膜样癌患者OS的Cox回归分析

图3 A.KIFC1表达与子宫内膜样癌患者累积生存率的关系;B.TCGA数据库中KIFC1 mRNA表达与子宫内膜样癌患者累积生存率的关系

3 讨论

子宫内膜癌是全球常见的妇科恶性肿瘤,最常见的病理类型是子宫内膜样癌,发病率和病死率均呈逐年升高趋势。老年患者绝经后再次有阴道出血症状有助于该病的早期诊断,多数患者可通过子宫切除后治愈,然而晚期患者预后较差[10-11]。因此,寻找有效的生物学标志物对提高早期检出率和靶向治疗至关重要。

1992年,KIFC1基因首次在人类主要组织相容性复合体Ⅱ基因的着丝粒片段中被发现[12]。KIFC1也被称为HSET,是黑腹果蝇的直系同源物,属于驱动蛋白14家族蛋白中的一员。在哺乳动物中,驱动蛋白14家族包含3个成员:KIFC1、KIFC2和KIFC3。KIFC1由663个氨基酸残基组成,广泛表达于骨髓、淋巴结、皮肤、脾脏、睾丸、膀胱和胃肠道系统,主要参与哺乳动物细胞中的微管交联和纺锤体组装,也在运输囊泡和细胞器、精子发生和神经元迁移中发挥重要作用。最近研究表明,KIFC1能聚集多余中心体维持癌细胞的存活,其在多种肿瘤中过表达,但对正常细胞的有害作用和抑制作用较小,提示KIFC1的靶向治疗或许在选择性抗肿瘤措施中具有重大的研究前景。因此,KIFC1已成为现阶段具有吸引力的癌症特异性标志物[13-14]。

既往研究显示,KIFC1在卵巢癌组织中高表达,其通过调节CNEPE调控卵巢癌细胞的增殖侵袭和转移[15]。KIFC1在肝细胞癌中高表达,并与肿瘤结节数量和肿瘤大小有相关性。此外,KIFC1过表达的患者OS和无复发生存率较低,沉默KIFC1的表达能显著抑制肝癌细胞的增殖和肿瘤的生长[16]。KIFC1在前列腺癌的细胞核中也有丰富的表达,使用AZ82降低KIFC1的表达后,可抑制前列腺癌细胞增殖,并且KIFC1 mRNA的表达随着前列腺癌Gleason评分和肿瘤分期的增加而增加,KIFC1在原发肿瘤中的表达高于癌旁正常组织,在转移性病变中的表达高于原发肿瘤,KIFC1 mRNA的高表达与前列腺癌患者无复发生存率较低相关。这些结果表明,KIFC1高表达与前列腺癌患者的不良预后相关,可作为前列腺癌患者的预后指标[3,17]。Sun等[18]对11项肿瘤的研究和2 424例患者的荟萃分析,阐明KIFC1过表达对肿瘤患者OS、无复发生存期和肿瘤临床病理特征的影响,KIFC1过表达与肿瘤恶性生物学行为、较低生存期和无复发生存期密切相关。本组结果发现子宫内膜样癌中KIFC1蛋白阳性率显著升高,KIFC1的mRNA、蛋白表达量在子宫内膜样癌组织中显著升高;TCGA数据库显示KIFC1 mRNA在子宫内膜样癌中的表达高于癌旁正常子宫内膜,两者结果一致推测KIFC1在子宫内膜样癌中作为促癌因子发挥作用。本组还发现,KIFC1与子宫内膜样癌的肌层浸润深度、FIGO分期和淋巴结转移均密切相关,推测KIFC1在子宫内膜样癌浸润转移中发挥促癌作用。为了进一步分析KIFC1与患者预后的关系,本组通过生存分析发现,KIFC1阳性、高FIGO分期、淋巴结转移患者的生存率降低;与KIFC1阴性者相比,KIFC1阳性患者的中位生存时间缩短,累积OS下降。Cox回归分析进一步发现,KIFC1阳性是子宫内膜样癌患者的危险因素,推测KIFC1与子宫内膜样癌患者预后关系密切,KIFC1阳性提示患者预后不良。因此,KIFC1可作为临床评估子宫内膜样癌患者预后的参考指标,与TCGA数据库中生存分析结果一致。

综上所述,子宫内膜样癌中KIFC1高表达与肿瘤肌层浸润深度、FIGO分期和淋巴结转移相关。临床试验需扩大样本量以便进一步分析具体作用机制,为患者的个体化治疗提供更有力的科学依据。