延胡索酸水合酶与2琥珀酸半胱氨酸在初筛延胡索酸水合酶缺陷型子宫平滑肌瘤的应用价值

方甜甜,施 凤,钱 宁,张维菊,顾 芸

遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma-associated renal cell carcinoma, HLRCC)综合征属于常染色体显性遗传性家族性疾病,是由延胡索酸水合酶(fumarate hydratase, FH)胚系基因突变引起的[1]。HLRCC以多发性皮肤和子宫平滑肌瘤为首发表现,即延胡索酸水合酶缺陷型(fumarate hydratase-deficient, FH-d),高达62%的患者发展为侵袭性肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)并于确诊5年内死亡[2]。因此,早期准确识别HLRCC的前哨病变—FH-d型平滑肌瘤,对筛查HLRCC患者具有重要意义[3]。奇异核平滑肌瘤(leiomyoma with bizarre nuclei, LBN)是具有非典型细胞核的子宫平滑肌肿瘤[4],包括I和Ⅱ型,其中I型LBN与FH-d型平滑肌瘤形态学有重叠,日常工作中大多数FH-d型平滑肌瘤均被诊断为LBN,这可能贻误HLRCC患者治疗时机。最近,文献报道FH和2琥珀酸半胱氨酸(2-succinocysteine, 2SC)是LBN与FH-d型平滑肌瘤鉴别诊断的标志物[5]。本文采用免疫组化染色分析FH和2SC的表达,探讨两者在具有奇异核特征平滑肌瘤的初筛FH-d型平滑肌瘤中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2013年1月～2020年12月我院行手术切除的具有奇异核特征平滑肌瘤石蜡标本67例,其中全子宫切除术21例,肌瘤旋切术30例,肌瘤挖除术16例。67例患者中44例因常规体检发现,其余为盆腔包块、月经量增多、经期延长和绝经后阴道异常出血等检查时发现。患者年龄24～68岁,平均39.5岁。肌瘤呈灰白色,部分灰黄、灰红色,质韧。29例肿瘤单发,33例肿瘤多发(肿瘤数量2～20枚不等),5例肿瘤数量未知。肿瘤最大径0.7～12 cm,平均5.75 cm。所有患者均否认皮肤平滑肌瘤、肾脏肿瘤病史。

1.2 方法评估肿瘤以下特征:奇异核的细胞密度(低:低于普通型平滑肌瘤的细胞密度;中:接近普通型平滑肌瘤的细胞密度;高:接近富于细胞型平滑肌瘤的细胞密度),细胞分布(局灶、多灶和弥漫),是否存在鹿角形血管,有无嗜酸性包涵体、显著嗜酸性大核仁和核仁周围空晕。依据FH-d形态学特征(包括细胞密度高、显著嗜酸性核仁、核仁周围空晕、胞质嗜酸性、细胞质纤维丝、鹿角形血管和胞质内嗜酸性包涵体),≥2项则认为具有FH-d形态平滑肌瘤。所有病例均由两名高级职称病理医师采用双盲法独立阅片。

1.3 免疫组化采用免疫组化EnVision两步法染色,一抗FH、2SC和二抗试剂盒均购自北京中杉金桥公司,具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。FH以肿瘤细胞胞质任何程度棕黄色颗粒状着色为阳性,以血管内皮细胞为阳性内对照。2SC以肿瘤细胞核或胞质弥漫棕黄色颗粒着色为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。患者年龄和肿瘤最大径为正态分布计量资料,组间比较采用t检验。其余计数资料采用例数和百分数表示,组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验,双侧校验水准α=0.05。

2 结果

2.1 临床病理特征镜下肿瘤均边界清楚,无浸润。奇异核细胞表现为圆形、椭圆形或多边形等多种怪异形状,呈多灶或弥漫分布,>1/2肿瘤细胞密度中等,与典型平滑肌瘤以梭形细胞为主不同。奇异核细胞核体积增大,核深染,核型不规则,形状怪异。部分奇异核细胞表现为显著的嗜酸性大核仁,核仁周围空晕(图1)。36例肿瘤内间质水肿,67例肿瘤胞质呈纤维丝样(图2),核分裂象少见,均未见肿瘤性坏死。

①②③④⑤⑥

2.2 免疫表型本组67例中FH阳性33例,阴性34例(图3);2SC阳性37例(图4),阴性30例。显著嗜酸性核仁、核仁周围空晕、嗜酸性包涵体(图5)和鹿角形血管(图6)常见于FH阴性组和2SC阳性组(P<0.05),与肿瘤数量、细胞密度、奇异核分布和间质水肿均无关(P>0.05,表1)。FH和2SC阳性与FH-d形态之间,差异有统计学意义(P<0.05,表2)。

表1 FH和2SC表达与具有奇异核特征平滑肌瘤临床病理特征的关系[n(%)]

表2 具有奇异核特征平滑肌瘤中FH和2SC的表达[n(%)]

2.3 FH和2SC表达的相关性67例肿瘤中有30例FH阳性、2SC阴性,34例FH阴性、2SC阳性,3例FH和2SC均阳性。Fisher确切概率法显示,FH与2SC的表达存在相关性(P<0.001)。

2.4 随访67例患者中有65例获得随访,时间2～116个月,中位数34个月。截至2022年10月31日,患者均存活。本组6例(8.95%)B超示复发,其中4例诊断为具有FH-d形态平滑肌瘤,且FH阴性、2SC阳性;2例为无FH-d形态平滑肌瘤,其FH阳性、2SC阴性。在27例具有FH-d形态平滑肌瘤组中,2例(FH均阴性、2SC均阳性)进行外周血样本DNA检测,1例未检测出已知致病变异,另1例患者检测到胚系FH基因疑似致病变异(FH c.1109-2A>c)。

3 讨论

HLRCC是由FH基因杂合突变引起的,发病机制有待进一步探索。HLRCC临床表现为多发性皮肤平滑肌瘤、子宫平滑肌瘤和RCC。其特点是侵袭性肾癌风险增加,该肾癌通常为2型乳头状RCC,且多数受累女性均表现为子宫肌瘤。患者确诊子宫肌瘤的中位年龄30岁,早于RCC(46岁)和普通型子宫平滑肌瘤(38岁)。研究认为,FH-d型平滑肌瘤是HLRCC的前哨病变。

LBN是良性平滑肌细胞肿瘤,约占子宫平滑肌源性肿瘤的1%[6],好发于中年女性,临床表现与普通型子宫平滑肌瘤无明显区别。LBN依据核形态分为:Ⅰ型LBN细胞核圆形或椭圆形,核膜清楚光滑,核仁突出,核仁周围可见空晕,染色质粗糙开放,奇异核细胞多弥漫性分布;Ⅱ型LBN细胞核长杆状或纺锤形,核膜不规则,核仁不明显或无核仁,染色质深染[7]。由于I型LBN与FH-d型平滑肌瘤组织学有重叠,导致绝大多数FH-d型平滑肌瘤被单纯诊断为LBN。因此,从具有奇异核特征平滑肌瘤中检测出FH-d型平滑肌瘤,识别早期HLRCC,将为HLRCC患者和直系亲属提供早发现、早治疗的机会。

FH基因位于染色体1q42.3上,在三羧酸循环中催化延胡索酸转化为L-苹果酸。FH基因突变存在多种类型,包括错义突变、移码突变和无义突变等[8],以错义突变最常见。FH基因活性的丧失引起延胡索酸积累,积聚的延胡索酸与不同蛋白上的半胱氨酸残基结合形成产物2SC[9]。FH酶活性的丧失主要表现:FH阴性、2SC阳性。本组FH-d型平滑肌瘤中FH敏感度为92.59%(25/27),特异度77.50%(31/40);2SC敏感度为96.30%(26/27),特异度为72.50%(29/40)。Joseph等[1]发现2SC阳性时提示FH基因发生突变,FH缺失特异性较高,但敏感度较低。由于稳定、无功能的蛋白产物可出现免疫组化表达[10],因此FH基因错义突变时其免疫标记也可能为阳性,FH阳性并不能排除HLRCC,单一利用FH免疫组化筛查FH-d型平滑肌瘤可能会出现遗漏。FH和2SC存在多种表达模式,本组有3例FH+、2SC+,30例FH+、2SC-,34例FH-、2SC+。3例FH+、2SC+均无FH-d形态,30例FH+、2SC-中仅1例(1/30,3.33%)具有FH-d形态,34例FH-、2SC+中25例(25/34,73.53%)具有FH-d形态,研究证实FH和2SC的免疫组化表达存在相关性。FH和2SC的表达与显著嗜酸性核仁、核仁周围空晕、嗜酸性包涵体和鹿角形血管均有关[11]。

免疫组化属于蛋白水平检测,FH缺失无法判断FH基因是胚系突变或体系突变。目前,分子遗传学检测是HLRCC综合征诊断的唯一方法。本组的不足之处在于只有2例具有FH-d形态的平滑肌瘤患者进行外周血DNA检测,1例存在FH胚系突变,对于FH和2SC均阳性的患者缺乏分子检测。

综上所述,LBN与FH-d型平滑肌瘤有形态学交叉,具有明显嗜酸性核仁、核仁周围空晕、胞质内嗜酸性包涵体和鹿角形血管的LBN应警惕FH-d型平滑肌瘤。FH和2SC在具有奇异核特征平滑肌瘤中识别FH-d型平滑肌瘤具有较高的敏感度和特异度,且两者表达有相关性。建议病理医师对FH-、2SC+和FH+、2SC+的LBN患者进行遗传咨询和基因检测,以早期识别HLRCC综合征。