微小RNA-451在小细胞性贫血及慢性感染贫血儿童血清中的表达及临床意义

徐金梅, 张利兵, 郁多男

(1. 扬州大学附属医院 儿科, 江苏 扬州, 225009;2. 扬州大学医学院 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室, 江苏 扬州, 225009)

小细胞性贫血主要是指缺铁性贫血,多发于6～12月龄的婴儿。轻度小细胞性贫血患儿表现为皮肤、黏膜苍白或苍黄,严重者可见头晕、全身乏力、烦躁不安、食欲不振等,且患儿往往伴有营养不良,贫血过久可导致生长发育障碍[1]。慢性感染贫血是慢性病贫血的一种,患者感染、炎症状态持续1个月以上,常伴有轻至中度贫血[2]。儿童贫血的原因具有多样性和复杂性,实施有效的科学干预是临床治疗该病的重要举措[3-5]。微小RNA(miRNAs)是一类长度为18～25个核苷酸的小分子非编码RNA[6], 可通过其种子序列与下游靶基因mRNA 3′非翻译区特定位点结合,从而抑制下游靶基因的mRNA翻译成蛋白质[7]。研究[8]表明,微小RNA-451(miR-451)会有效破坏小鼠红细胞系的稳态性,而红细胞数量是贫血的诊断指标之一。研究[9-10]显示,敲除miR-451后,小鼠会发生小细胞低色素性贫血,且miR-451对小鼠缺铁性贫血和β-地中海贫血也存在一定影响。由此可见, miR-451或可成为临床诊断和治疗红细胞疾病的一种生物学指标。本研究探讨miR-451在小细胞性贫血和慢性感染贫血儿童血清中的表达及诊断价值,以期为临床针对性治疗儿童贫血提供一定的理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021年12月—2022年12月扬州大学附属医院收治的确诊小细胞性贫血、慢性感染贫血的儿童各80例,分别纳入小细胞性贫血组、慢性感染贫血组,不同类型贫血的诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》[11]。纳入标准: ① 根据血常规等实验室检查结果和临床表现确诊贫血者; ② 临床资料完整者; ③ 依从性好者; ④ 对本研究知情且签署知情同意书者。排除标准: ① 合并恶性肿瘤者; ② 存在肝、肾等重要脏器功能不全者; ③ 合并多种血液系统疾病和免疫源性疾病者; ④ 合并原发性高血压、凝血功能障碍者; ⑤合并经血液传播疾病者; ⑥ 存在精神异常、意识功能障碍者。另选取同期健康儿童80例,纳入健康对照组。本研究获得医院伦理委员会审核批准,所有儿童及家属对本研究知情且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血常规检测: 采集各组儿童空腹静脉血3.5 mL, 抽血过程中确保穿刺部位皮肤无感染及皮疹,常规消毒后,于肘正中行静脉穿刺处理, 60 s内完成静脉血采集,置于EDTA抗凝血管内充分颠倒混匀。使用日本SySMEX XN-100全自动血液分析仪及其相应配套试剂检测血常规指标,包括红细胞分布宽度(RDW)、红细胞(RBC)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血红蛋白(Hb)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞体积(MCV)等。确认各参数的正常参考值范围, RBC为(3.50～5.80)×1012/L, Hb为110～172 g/L, MCH为27～34 pg, MCV为82～100 fL, MCHC为321～362 g/L, RDW为11.6%～16.0%。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-451表达: 首先通过Trizol法提取总RNA, 检测RNA浓度和OD260 nm/OD280 nm, 然后进行cDNA的反转录合成,其反应体系为总RNA 1 μg+mRQ Buffer(2×)5 μL+mRQ Enzyme 1.25 μL+无酶水补至10 μL, 再用PCR扩增仪扩增获得cDNA产物。qRT-PCR通过Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行操作,反应体系为SYBR预混料Ex Taq Ⅱ 10.0 μL+ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL+上游引物(10 μmol/L)0.4 μL+下游引物(10 μmol/L)0.4 μL+ CDNA模板1.6 μL+DEPC水7.2 μL, 合计20 μL。反应条件为94 ℃ 5 min, 1个循环; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 70 ℃ 30 s, 40个循环; 94 ℃ 1 min, 55 ℃ 30 s, 95 ℃ 30 s, 1个循环。miR-451上游引物5′-AAACCGTTACCATTACTGAGTT -3′, 下游引物qRT-PCR试剂盒通用引物[12];GAPDH上游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGACT-3′, 下游引物5′-ACCTGGACCTGGACCTGGGAT-3′。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 3组儿童一般资料比较

3组儿童年龄、性别比较,差异无统计学意义(P>0.05); 小细胞性贫血组、慢性感染贫血组儿童体质量指数(BMI)均低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05); 小细胞性贫血组儿童的BMI、病程、临床表现与慢性感染贫血组比较,差异无统计学意义(P>0.05), 见表1。

表1 3组儿童一般资料比较

2.2 3组儿童红细胞相关参数比较

小细胞性贫血组、慢性感染贫血组儿童RDW均高于健康对照组, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV均低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05); 小细胞性贫血组儿童Hb、RBC均低于慢性感染贫血组,差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

表2 3组儿童红细胞相关参数比较

2.3 3组儿童血清miR-451表达水平比较

qRT-PCR检测结果显示,与健康对照组相比,小细胞性贫血组、慢性感染贫血组儿童血清miR-451表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05); 小细胞性贫血组血清miR-451表达水平与慢性感染贫血组比较,差异无统计学意义(P>0.05), 见图1。

2组比较, *P<0.05; NS表示2组差异无统计学意义。

2.4 血清miR-451与红细胞相关参数的相关性

Pearson相关分析结果显示, miR-451与RDW呈负相关(r=-0.388,P<0.05), miR-451与Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分别呈正相关(r=0.402、0.393、0.391、0.360、0.323,P<0.05), 见表3。

表3 血清miR-451表达与红细胞相关参数的相关性分析

2.5 miR-451、红细胞相关参数对小细胞性贫血的诊断价值

ROC曲线分析结果显示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451诊断小细胞性贫血的曲线下面积(AUC)分别为0.602、0.633、0.645、0.621、0.633、0.610、0.718, 灵敏度、特异度均较高,其中miR-451的诊断价值高于6项红细胞相关参数,差异有统计学意义(P<0.05), 见表4、图2。

图2 miR-451、红细胞相关参数诊断小细胞性贫血的ROC曲线

表4 miR-451、红细胞相关参数对小细胞性贫血的诊断效能

2.6 miR-451、红细胞相关参数对慢性感染贫血的诊断价值

ROC曲线分析结果显示, RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451诊断慢性感染贫血的AUC分别为0.600、0.612、0.633、0.602、0.614、0.618、0.735, 灵敏度、特异度均较高,其中miR-451的诊断价值高于6项红细胞相关参数,差异有统计学意义(P<0.05), 见图3、表5。

图3 miR-451、红细胞相关参数诊断慢性感染贫血的ROC曲线

表5 miR-451、红细胞相关参数对慢性感染贫血的诊断效能

2.7 小细胞性贫血影响因素的多因素Logistic回归分析

多因素Logistic回归分析结果显示,年龄、性别不是儿童发生小细胞性贫血的影响因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均为儿童发生小细胞性贫血的影响因素(P<0.05), 见表6。

表6 小细胞性贫血影响因素的多因素Logisitic回归分析

2.8 慢性感染贫血影响因素的多因素Logistic回归分析

多因素Logistic回归分析结果显示,年龄、性别不是儿童发生慢性感染贫血的影响因素(P>0.05), BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均为儿童发生慢性感染贫血的影响因素(P<0.05), 见表7。

表7 慢性感染贫血影响因素的多因素Logisitic回归分析

2.9 血清miR-451表达对贫血严重程度的诊断价值

根据Hb水平的不同将160例贫血儿童划分为轻度组(Hb>90～120 g/L,n=45, 占28.12%)、中度组(Hb>60～90 g/L,n=68, 占42.50%)和重度组(Hb为30～60 g/L,n=47, 占29.38%)。qRT-PCR检测结果显示,中度组、重度组血清miR-451表达水平均低于轻度组,且重度组低于中度组,差异有统计学意义(P<0.05), 表明随着儿童贫血程度的加重,血清miR-451表达水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05), 见图4。ROC曲线分析结果显示,随着贫血程度的加重, miR-451的AUC、特异度逐渐增加(P<0.05), 表明血清miR-451水平对儿童贫血严重程度具有较高的诊断价值,见表8。

与轻度组比较, *P<0.05; 与中度组比较, #P<0.05。

表8 miR-451对贫血严重程度的诊断效能

3 讨 论

小细胞性贫血是指机体红细胞因缺乏某些必要的营养物质(如铁等)而不能正常合成引起的贫血现象[13-14], 临床发病率较高,但经合理治疗后,患者一般预后良好[15-16]。慢性感染贫血是慢性病贫血的一种类型,其发病原因之一是微生物入侵直接造成骨髓造血组织被破坏,另一原因是细菌产生的内外毒素引起间接性作用[17-18], 最终导致感染患者血细胞减少及骨髓再生功能障碍,临床表现为网织红细胞增多,红细胞寿命缩短,机体存在不同程度溶血现象[19]。尽管临床医师可以鉴别小细胞性贫血和慢性感染贫血,但目前关于小细胞性贫血、慢性感染贫血临床特征的比较研究仍较少。本研究结果显示, 3组儿童年龄、性别无显著差异,但2组贫血儿童的BMI显著低于健康对照组儿童,此外小细胞性贫血组、慢性感染贫血组的BMI、病程、临床表现(乏力、食欲不振、头晕)无显著差异,与既往研究[20-21]结果相近。目前贫血类型的临床诊断大多通过溶血筛查,血常规指标中具有代表意义的红细胞相关参数包括RBC、RDW、Hb和MCV, 检验过程相对简单,可为贫血诊断提供可靠依据[22-24]。本研究结果显示,与健康对照组相比, 2组贫血患儿的RDW显著升高, RBC、MCHC、Hb、MCH、MCV则显著降低,且小细胞性贫血组患儿Hb、RBC显著低于慢性感染贫血组,表明贫血患儿红细胞相关参数存在明显异常,与既往研究[23-24]结论一致。

miR-451基因位于第11号染色体上,与miR-144基因来自同一基因簇[25-26]。研究[27-28]表明, miR-451在斑马鱼、小鼠及人类红细胞中的表达存在显著差异。血液miR-451、miR-144表达与贫血类型密切相关,例如地中海贫血患者血液miR-451、miR-144表达显著低于健康对照者,提示miR-451、miR-144表达与此类患者红细胞生成存在关联[10-11]。相关研究[29]在斑马鱼的红细胞内发现一些造血相关转录因子,其可以激活miR-451、miR-144的表达,从而调控红细胞的分化和生成。小鼠模型中,慢性病毒载体可抑制miR-451的表达,使红细胞氧化应激能力增强,导致贫血程度加重,提示miR-451在原始红细胞的分化过程中起着关键作用[13, 30-32]。

本研究发现,与健康对照组相比,小细胞性贫血组和慢性感染贫血组患儿外周血中miR-451表达显著降低,提示miR-451与贫血的病理进程存在关联。Pearson相关分析显示,贫血儿童miR-451与RDW呈负相关,与Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV分别呈正相关,即随着血清miR-451表达水平的升高, RDW水平逐渐降低, Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV水平逐渐升高。由此提示, miR-451表达水平可在一定程度上预测机体红细胞相关参数,进而预测贫血的发生。本研究中, ROC曲线分析结果显示, miR-451诊断小细胞性贫血、慢性感染贫血的AUC均显著大于RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV, 多因素Logistic回归分析结果显示, BMI、RDW、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451均为儿童发生小细胞性贫血、慢性感染贫血的影响因素,即较低的BMI、Hb、RBC、MCHC、MCH、MCV、miR-451水平和较高的RDW水平均会增加儿童发生小细胞性贫血、慢性感染贫血的概率。本研究结果还显示,随着儿童贫血程度的加重,血清miR-451表达水平显著降低,进一步行ROC曲线分析发现,血清miR-451水平对儿童贫血严重程度具有较高的诊断价值。

综上所述, miR-451在小细胞性贫血、慢性感染贫血儿童血清中表达降低,且其表达水平与红细胞相关参数具有相关性,血清miR-451对小细胞性贫血、慢性感染贫血和贫血严重程度均具有较高的诊断价值,建议在临床推广应用。