基于高通量实时荧光定量聚合酶链式反应技术探究铜对猪粪厌氧发酵产物中抗生素抗性基因的分布特征影响*

龚陈盼 张然然,2# 庄海峰 周柳媛

(1.浙江科技学院浙江省废弃生物质循环利用与生态处理技术重点实验室,浙江 杭州 310023;2.西北工业大学生态环境学院,陕西 西安 710129)

随着养殖业规模的不断扩大,为了增强畜禽免疫力,提高养殖业的经济效益,抗生素和重金属被广泛作为饲料添加剂,这些添加剂滥用导致重金属和抗生素含量远超生物生长所需,动物肠胃中抗生素和重金属无法被完全吸收,过量的抗生素在动物肠道中会诱导出抗性微生物,最终通过排泄物排出体外,造成畜禽粪便中抗生素残留,诱导出抗生素抗性基因(ARGs),因此畜禽粪便成为了ARGs的重要储存库[1]。ZHU等[2]研究发现猪粪中ARGs种类多样,共检测出149种ARGs亚型。ARGs传播扩散会诱导环境介质中微生物获得抗性,进而出现“超级细菌”严重威胁人类健康,临床卫生安全也将面临巨大的挑战[3-4]。

厌氧发酵是粪肥资源化利用的主要处理方式[5],粪污通过发酵可以生产沼气等清洁能源,产物中的沼渣、沼液也是优质有机原料,可改良土壤。然而有研究发现厌氧发酵处理后的发酵产物中存在部分ARGs富集现象[6]。例如SUN等[7]研究发现牛粪厌氧发酵过程中氟喹诺酮抗性基因具有较高的持久性和富集动态。LU等[8]研究发现牛粪厌氧发酵后的沼渣沼液中多数ARGs丰度均要高于牛粪,且沼渣贮藏1个月后,磺胺类抗性基因富集程度显著升高。发酵产物的沼渣沼液施用于农田会增加ARGs输入食物链的风险,进而影响农作物生长和农产品安全[9]。

重金属铜作为主要的饲料添加剂广泛应用于养殖场,研究发现猪粪中有大量的铜残留[10-11],可达286.7～1 905.0 mg/kg[12]。与抗生素相比,重金属污染对ARGs的影响更为深远,因为重金属在环境介质中不易降解,同时还会对ARGs施加选择性压力,使得微生物对重金属也产生抗性,进而诱导出重金属抗性基因[13],在提高环境中ARGs多样性的同时也加剧了多重ARGs的传播风险。杨统一等[14]研究发现施用粪肥后的土壤重金属含量显著增加,尤其是铜、锌,其含量与多种ARGs丰度呈显著正相关,说明重金属的赋存可能参与了ARGs共选择。SUN等[15]研究发现受到抗生素和重金属复合污染的粪肥中,sul1和sul2丰度显著升高,但其研究使用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术测得的ARGs数量较为单一,仅是测定了两种四环素类抗性基因和两种磺胺类抗性基因。在厌氧发酵体系下,关于重金属铜对发酵产物中多种ARGs的分布特征研究较少,张然然[16]研究发现锌、铜都显著提高了猪粪厌氧发酵过程及产物中ARGs和可移动基因元件(MGEs)丰度,但仅测定了15种ARGs和4种MGEs,不能全面解释各类ARGs的分布特征。现实污染环境条件多样且复杂,以往多数研究采用传统的聚合酶链式反应(PCR)技术,侧重于对有限种类的ARGs的定性与定量,但对各类ARGs的分布特征缺乏系统性解读。

为了管控有机肥施用导致ARGs在土壤生态系统中的扩散传播,考虑到重金属赋存可能会提高ARGs的传播扩散风险,更全面更系统地探讨受铜污染的发酵产物中ARGs多样性及分布特征显得尤为重要。本研究模拟了两种水平铜污染(75、227 mg/L)对猪粪厌氧发酵产物中ARGs和MGEs分布特征的影响,采用高通量实时荧光定量聚合酶链式反应(HT-qPCR)技术,共使用354组引物检测296个ARGs、57个MGEs,定量分析发酵产物中ARGs的丰度变化及各类ARGs之间的相关性特征。本研究为评价铜在诱导微生物抗生素抗性中的作用提供了基础数据,对防控粪肥施用于农田的风险提供了理论评估依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及实验设置

本研究使用的猪粪来自西北农林科技大学的一个中型农场。猪粪pH为7.87,总固体质量分数为41%,含碳量为398.29 g/kg,含氮量为26.57 g/kg。小麦秸秆pH为5.37,总固体质量分数为98%,含氮量为6.77 g/kg,含碳量为493.63 g/kg。将猪粪和小麦秸秆按一定比例混合后调节C/N(质量比)为20∶1,用去离子水使厌氧发酵体系的最初总固体质量分数维持在8%。厌氧发酵装置参考文献[17]、[18],实验每个处理设置3个重复。实验所用的CuCl2纯度为99.0%,ACS级。参考文献[19]的操作(设置猪粪中铜平均质量浓度为500 mg/kg(基于猪粪干质量,下同),最大质量浓度为1 500 mg/kg),本研究在厌氧发酵体系中共设置了1个对照组(CK,不添加铜)和两个铜处理组(CuL中含铜75 mg/L,CuH中含铜227 mg/L)。厌氧发酵体系混合均匀后立即采集CK的3个平行作为0 d样品。所有3种处理在52 d后收集100 mL样品于棕色瓶中用于后续分析。

1.2 脱氧核糖核酸(DNA)提取和HT-qPCR

DNA的提取:冷干样品利用FastDNA SPIN Kit for Soils试剂盒(MP Biomedicals)由 100 mg样品中提取总基因组DNA,用低共熔溶剂(DES)洗脱总DNA。采用1.5%(质量分数)凝胶电泳和酶板仪(Biotek Elx808)检测分析DNA提取物的质量和浓度。HT-qPCR采用广东某科技有限公司的SmartChip实时PCR系统进行。总共使用354组引物检测296个ARGs、34个转座子、11个质粒、9个插入序列、3个整合子。所有HT-qPCR均进行3次技术重复。

2 结 果

2.1 ARGs和MGEs数量的变化

3组不同处理下ARGs和MGEs数量如图1所示,总共检测到152个ARGs,涵盖11个主要类别(包括氨基糖苷类、四环素类、多药类、磺胺类等抗性基因)和33个MGEs(16个转座子、7个插入序列、7个质粒和3个整合子)。

注:相对丰度由绝对丰度除以16S rDNA总量计算得出,图2和图3同。

CK、CuL和CuH中分别检测到118、152和138个ARGs。铜处理组检测到的ARGs数量多于CK。产物中检测出多药类和氨基糖苷类抗性基因最为丰富,均占所有处理中检测到的ARGs数量总和的20%以上,其次是大环内酯类和四环素类抗性基因。CK、CuL和CuH中分别检测到28、35和31个MGEs,大多数MGEs在3组处理中均被检测出。

2.2 ARGs和MGEs相对丰度的分布特征

CuH中ARGs总相对丰度高于CuL和CK。与CK相比,CuL和CuH中ARGs总相对丰度分别提高了86%和91%。氨基糖苷类抗性基因相对丰度最高,其次就是四环素类抗性基因。CuH中四环素类抗性基因相对丰度分别是CK和CuL的3.6、1.5倍。多药类和磺胺类抗性基因在铜处理组中的相对丰度占比明显高于CK。在铜处理组中的MGEs相对丰度显著(P<0.05,下同)高于CK,其中部分转座子(如IS6100、IS613)和整合子(如intI1)的相对丰度在CuL中高于CuH。总体来看,受到铜污染的发酵体系中所检测出的ARGs和MGEs相对丰度要显著高于CK,且同一基因对不同浓度铜的响应不同,以下分别对各大类别的ARGs和MGEs进行分布特征分析,结果见图2与图3。

图2 3组处理下的ARGs相对丰度的变化

图3 3组处理下的MGEs相对丰度的变化

2.2.1 氨基糖苷类抗性基因

铜处理组下的氨基糖苷类抗性基因相对丰度要显著高于CK,一些氨基糖苷类抗性基因的相对丰度在CuH中较高,尤其是aadA99、aadA17和aadA21,除此之外的大部分氨基糖苷类抗性基因相对丰度普遍表现为CuL高于CuH。

2.2.2 四环素类抗性基因

在四环素类抗性基因中,CuH中tetM的相对丰度最高,分别是CK和CuL的4.1、1.3倍。CuH中tet(44)、tetA(P)和tetG的相对丰度高于CK和CuL。在四环素类抗性基因中,只有tet(32)相对丰度表现为CuL高于CuH和CK。

2.2.3 多药类抗性基因

与CK相比,多药类抗性基因的相对丰度在铜处理组中均得到富集。CuL和CuH的qacH351相对丰度分别是CK的14.0、12.6倍。CuH的mefB相对丰度分别是CuL和CK的2.4、7.0倍。

2.2.4 β-内酰胺类抗性基因

对于β-内酰胺类抗性基因,其在CuL的相对丰度均高于CuH和CK,且ant(6)-Ia和aph(3”)-ia相对丰度在铜处理组中较高。

2.2.5 大环内酯类与磺胺类抗性基因

大环内酯类抗性基因ermF在所有处理中相对丰度均最高,表现为CuL>CuH>CK。大多数抗性基因在CuL中的相对丰度高于CuH和CK。此外,erm(36)和mphA、vatE、ermG仅在铜处理组中检测到。磺胺类抗性基因sul1在CuL中的相对丰度高于CK和CuH,总体来看,磺胺类抗性基因在铜处理组中得到了富集。

2.2.6 MGEs

CuH和CuL中intI1和intI2相对丰度高于CK。CuH和CuL中部分质粒的相对丰度高于CK,尤其是CuH的pBS228-IncP-1α相对丰度分别是CuL和CK的2.0、5.0倍。此外,大部分插入序列的相对丰度在铜处理组中保持较高相对丰度,但TN5只在CK中被检测出。大多数转座子在CuH和CuL中的相对丰度均高于CK。

2.3 相关性分析结果

对厌氧发酵产物中ARGs与MGEs相对丰度进行Pearson相关性分析,绘制相关性气泡图(见图4),氨基糖苷类、磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类、多药类、氯霉素类、甲氧苄氨嘧啶类抗性基因之间的相对丰度都呈显著正相关。

注:图中氨基糖苷类抗性基因简写为氨基糖苷类,其余以此类推。

对比厌氧发酵产物中ARGs与MGEs相对丰度的相关性可以得出,氨基糖苷类、磺胺类、β-内酰胺类、大环内酯类、多药类、氯霉素类、甲氧苄啶类抗性基因总和与MGEs呈极显著(P<0.01)正相关,四环素类抗性基因与MGEs呈显著正相关。

3 讨 论

从ARGs数量水平上来看,发酵产物中ARGs种类非常丰富,其中检测到多药类抗性基因数量最多,其次为氨基糖苷类;但在相对丰度水平上,氨基糖苷类抗性基因的相对丰度最高,约占ARGs总相对丰度60%以上,其次是四环素类、多药类和磺胺类抗性基因。氨基糖苷类抗性基因的高相对丰度特征主要归因于氨基糖苷类是较为广泛和高使用率的抗生素[20-21],可能在发酵过程中存在较高的持久性。QIAO等[22]发现四环素类、磺胺类抗生素在畜禽粪便中检出率较高,这与本研究测得的结果相佐。

在本研究中,受到铜污染的发酵体系检测的ARGs相对丰度都高于CK,说明铜通过协同和交叉选择增加了ARGs丰度[23]。通过对各类ARGs分布特征的描述,也可以发现不同ARGs对不同浓度的铜也表现出了多样的响应特征,其中多数的氨基糖苷类、大环内酯类和β-内酰胺类抗性基因相对丰度在CuL中较高;而四环素类抗性基因在CuH中保持较高相对丰度。此外,同一ARGs对不同浓度的铜的响应也不同,例如CuH中tetM、tet(44)相对丰度高于CuL,而铜处理组中tetB(p)、tetT相对丰度却要低于CK。经过Pearson相关性分析,发现多数ARGs之间也存在显著相关性,值得关注的是糖肽类抗性基因与检测到的其他ARGs相关性均较弱。万古霉素作为临床医学中用于治疗细菌感染的重要抗生素,被誉为人类的最后一道防线[24],它也是糖肽类抗生素的一种。铜处理没有显著提高万古霉素抗性基因相对丰度。总体来说,铜能影响发酵体系中的ARGs分布特征,且有增加体系中大多数ARGs污染水平的趋势。

在铜处理下的MGEs总相对丰度要显著高于CK,其中转座子和部分整合子(intI1和intI2)相对丰度在铜处理组中显著增加,WU等[25]在猪粪和秸秆混合好氧堆肥研究中也发现整合子intI1和转座子IS6100持续以高丰度存在。整合子是水平基因转移的重要指标之一,对ARGs的转移有重要影响[26]。本研究中发现铜污染后的发酵产物中intI1相对丰度显著增高,且通过对厌氧发酵产物中的ARGs和MGEs进行Pearson相关性分析,发现了多数ARGs与MGEs之间存在着显著相关性,这与课题组先前的研究结果[27]一致。与CK相比,CuL和CuH中MGEs的相对丰度更高。这些结果也表明,受到铜污染的发酵体系提高了ARGs基因水平转移的能力,可能会加剧环境中ARGs的传播风险。因此施用有机肥后农田土壤ARGs传播的风险不容忽视,同时也应该关注MGEs丰度及其对ARGs转移和传播的影响机制。

课题组先前的研究发现在受到铜污染猪粪的厌氧发酵体系中,添加氧化石墨烯可显著降低ARGs和MGEs丰度[28]。针对复杂的发酵体系,添加有效的基质和添加剂对ARGs的响应还有待进一步研究。因此应该控制饲料添加剂中重金属含量,严格控制动物粪便中重金属含量,以减少ARGs的传播风险。

4 结 论

未受到铜污染的猪粪经过厌氧发酵后仍检测到丰富的ARGs。多药类抗性基因数量最多,其次为氨基糖苷类抗性基因,并且受到铜污染的发酵产物中新增了多种ARGs。然而在相对丰度水平上,氨基糖苷类ARGs的相对丰度最高,其次是四环素类、多药类和磺胺类抗性基因。相较于CK,在受到铜污染的厌氧发酵产物中ARGs和MGEs丰度均显著增加,不同ARGs对铜的响应不同,同一种ARGs对不同浓度水平的铜胁迫反应也不同。铜会提升基因水平转移的趋势,也促进ARGs和MGEs的共选择。ARGs与MGEs多呈显著正相关性,MGEs对ARGs传播扩散的促进水平可能在铜的选择压力下被放大了。