治疗性抗体半衰期研究进展

吴亚辉 ，罗龙龙*，张冉

（1. 湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410205；2. 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所重大疫情应急防控药物研究室，北京 100850）

近年来，随着抗体制备技术的不断发展和成熟以及抗体在临床应用过程中突出的疗效，治疗性抗体药物被广泛应用于恶性肿瘤、免疫性疾病、感染性疾病和心血管疾病等治疗领域[1]。据统计，截至2023年7月20日，全球已上市及在研抗体药物（含生物类似药）共计6367个，其中占比最多的是传统免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体，其次是抗体-药物偶联物（antibodydrug conjugates，ADCs）、双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）和小分子抗体[2]。与此同时，全球治疗性抗体药物的市场份额也一直处在快速增长过程中，从1997年的3亿美元增长至2022年的2200亿美元。因此，对治疗性抗体药物的研发和性能优化是目前国际创新型新药开发的热点之一。

在对治疗性抗体药物的研究过程中，不仅需要考虑其与抗原结合的特异性、免疫原性和自身理化性质等问题[3]，抗体的药代动力学（pharmacokinetics，PK）特征也是一个影响其临床应用的重要因素。描述药物PK的重要参数之一，即药物半衰期，指的是体内药物血液浓度降至一半所需要的时间。通常，对药物半衰期的适当延长能提高药效、减少给药剂量和给药频率，进而更便于临床治疗并减轻患者的治疗负担[4]。近年来，有关如何延长治疗性抗体药物半衰期的研究主要集中在目前临床常用的IgG抗体以及半衰期较短的纳米抗体（nanobody，Nb）。

IgG是人体血清中含量最为丰富的抗体，占血液循环中所有抗体的75%[5]，是由2条重链和2条轻链通过二硫键连接构成的Y型对称结构的大分子蛋白质，其相对分子质量为150000。根据其功能又可将结构分为2个特异性识别靶抗原的抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）、2个恒定的可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）和连接Fab段与Fc段的铰链区[6]。IgG具有比其他亚型抗体更长的血清半衰期，一般在10 ～ 21 d，这一特性使得IgG类抗体药物的药效更持久、给药频率和剂量也相应降低，成为目前为止临床上应用最为广泛的抗体药物类型[7]。IgG的高血清滴度和较长的血清半衰期特性由许多与结构和功能相关的因素决定，包括新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor，FcRn）介导的循环、总电荷量、疏水性大小、等电点（isoelectric point，pI）、糖基化修饰等，其中，FcRn介导的循环机制是最为重要的影响因素。血液中循环的IgG通过胞饮作用或受体介导的内吞作用被内皮细胞或单核细胞吸收后，IgG在酸性环境中（pH = 6.0），其Fc段与FcRn相互作用，使得IgG与FcRn结合。然后，结合的IgG被转运至细胞表面，并在达到生理pH值（pH = 7.4）时又被释放至血液中，使这一部分的IgG又能被重复利用[3]。基于以上这些因素，针对IgG半衰期延长的方法学研究也在不断开展，力求提高IgG类抗体药物的半衰期，使其满足临床实际需求。

小分子抗体主要包括单链抗体（single chain variable fragments，scFv）[8]、Nb[9]和Fab段等，其中Nb的相对分子质量最小（＜15000），仅由1个来自于骆驼的重链抗体的可变区结构域构成。自1993年Hamers-Casterman等[10]在骆驼血清中发现天然重链抗体以来，研究者们对Nb产生了浓厚的兴趣，众多研究成果表明，Nb具有比传统抗体更好的组织穿透能力[8]，免疫原性小[11]，能以可溶性形式在原核或真核系统中高表达，稳定性也比其他小分子抗体更高[12]。以上这些优势促使Nb在治疗性药物开发、诊断以及物质检测等领域的研究被迅速推进，2019年，全球首个Nb药物caplacizumab（用于治疗罕见凝血障碍的二价Nb）被美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入市场，并且同时有十几种Nb药物正处于临床试验研究阶段[13]。但是，由于Nb的相对分子质量远小于肾滤过屏障所允许滤除的最大蛋白质的相对分子质量（50000 ～ 60000），使得Nb可直接并迅速被肾脏清除，导致其半衰期极短，通常在几分钟至几小时之间。因此，延长Nb半衰期成为了进一步改善Nb药物疗效的重要方向之一。目前，以蛋白融合、化学修饰、红细胞载体和多价Nb为主的策略被应用到Nb半衰期改造的研究中。

本文主要介绍了延长IgG和Nb半衰期的一些方法。针对IgG的半衰期改造，我们从Fc段改造、pI改造、糖基化改造、pH依赖性抗原结合抗体等方面对其改造原理、改造常用的方法及其缺陷和创新性技术进行了详细介绍。另外，对于Nb的半衰期改造，我们以蛋白融合、化学修饰和红细胞载体为重点，同样从原理、常用方法及其优缺点和创新性技术等方面进行了概述。最后，针对现有治疗性抗体半衰期改造方法所存在的一些问题，对未来治疗性抗体药物半衰期改造可能的新策略和趋势进行展望。

1 IgG的半衰期改造

1.1 Fc段改造

由于IgG的Fc段与FcRn的pH依赖性的相互结合及循环机制对IgG的半衰期特征十分重要，研究者们主要通过优化Fc段的蛋白序列来改善两者间的结合强度，提高两者在酸性（pH = 6）条件下的结合并维持两者在中性（pH = 7.4）条件下的正常解离，从而延长IgG的半衰期。优化Fc段传统方法包括丙氨酸扫描[14]、定点诱变[15-18]、分子建模[4]和随机突变[17]，通过替换IgG的Fc段中与FcRn结合位点或位点附近的氨基酸，从而获得Fc段变体库，再结合噬菌体展示技术进行蛋白质筛选并验证，最终得到与FcRn高亲和力结合的Fc段变体，从而突破了以往单点突变所带来的局限性。其中，最经典的且已被广泛引入到临床治疗性IgG抗体中的突变组合有YTE（M252Y/S254T/T256E）[19-21]和LS（M428L/N434S）[22-23]，它们能在不影响IgG的Fab段与靶抗原的结合亲和力的情况下增强与FcRn的结合，从而延长IgG抗体的半衰期。在具体的临床应用中，经过YTE改造后针对呼吸道合胞病毒的莫塔韦单抗（motavizumab）对人FcRn的亲和力提高了10倍，且半衰期延长至60 d以上[19]；另外，YTE改造后针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SRAS-CoV-2）抗体药物AZD7442的半衰期延长了近3倍[24-25]。除此之外，LS同样也被引入到用于治疗新型冠状病毒感染（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的索托韦单抗（sotrovimab）中以延长其半衰期[23]，而Zalevsky等[4]也通过在贝伐单抗（bevacizumab）的Fc段引入LS突变，使得bevacizumab在食蟹猴体内的半衰期从9.7 d延长至31.1 d。

在某些情况下，Fc段突变不可避免地会对IgG抗体中Fc段的其他效应器功能和自身稳定性带来影响。为了解决这一问题， Booth等[26]开发了一种基于结构分析和网络分析的框架，通过分析在酸性条件下Fc段与FcRn的结合的结构域，在维持Fc段与具有效应器功能的受体[补体第1成分q（complement component 1q，C1q）、三基序蛋白21（tripartite -motif protein 21，TRIM21）、FcγRI、FcγRIIa/b、 FcγRIIIa等]的正常结合的条件下，绘制出各个突变相互作用的网络图，并将筛选后得到的突变进行组合，再评估组合突变体的性能。最终筛选得到5种Fc段突变组合DF183（T256D/Q311V/A378V）、DF197（H285N/T307Q/N315D）、DF213（H285D/T307Q/A378V）、DF215（T307Q/Q311V/A378V）、DF228（T256D/H286D/T307R/Q311V/A378V）。且其验证实验表明，DF228突变型motavizumab在食蟹猴中的半衰期与野生型相比提高了3.5倍（与YTE突变型相当甚至有所提高）[19]。Mackness等[27]运用点饱和突变技术在IgG1 Fc段的11处与FcRn结合位点进行了突变并筛选得到3种不破坏IgG与FcγRⅢa的结合亲和力、IgG与FcRn结合的pH依赖性、并且与人体内关键免疫原性标志物RF的结合亲和力低的组合变体YD（M252Y/T256D）、DQ（T256D/T307Q）和DW（T256D/T307W）。而为了维持抗体突变体的稳定性，Borrok等[28]通过分析TM（L234F/L235E/P331S）-YTE中单个突变对抗体热稳定性的影响，随后用提高热稳定性的新突变取代不稳定突变的方法发现了一种新的组合突变体FQQ-YTE（L234F/L235Q/K322Q/M252Y/S254T/T256E），其稳定性比TM-YTE更高且具有与TM-YTE相同的生物活性。Lee等[29]以优化Fc段与FcRn结合的pH依赖性为目的，从Fc段突变库中筛选获得了一种新的组合突变L309D/Q311H/N434S（DHS），其在保持IgG完整的效应功能的同时，显著提高了IgG的半衰期；Ko等[30]同样以优化Fc段与FcRn结合的pH依赖性为目的，利用膜蛋白漂移和组装（membrane protein drift and assembly，MPDA）细菌展示系统，从Fc段变体库中筛选得到一种新的组合突变PFc29（Q311R/M428L），曲妥珠单抗（trastuzumab）-PFc29在食蟹猴模型中的半衰期比trastuzumab-YTE和trastuzumab -LS的半衰期增加了6 d左右，同时增强了trastuzumab的补体依赖的细胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。为了进一步提高Fc段变体库的通量并降低筛选的成本，Chen等[31]开发了一种基于哺乳动物展示技术和二代测序技术的Fc变体库筛选方法，将Fc段变体库的通量由以前的数千个增加至数百万个，并且哺乳动物展示技术与噬菌体展示技术或酵母菌展示技术相比，能较大程度地保留了IgG Fc段的糖基化结构，使得Fc段改造与IgG糖基化改造很好地结合并筛选出性能更强的工程化IgG抗体。

综上所述，在对IgG的Fc段进行改造以增强Fc段与FcRn的结合并延长其半衰期的同时，不仅需要在提高酸性的条件下保持Fc段与FcRn的结合力，同时维持中性的条件下两者的正常解离，还需要考虑改造后的Fc段对IgG其他性能的影响，如结构稳定性、与靶抗原的结合亲和力（Fab段的功能）、与补体或其他Fc段功能性受体的结合亲和力等。再者，Fc段突变所导致的IgG半衰期延长在体内与体外以及不同物种间都是存在差异的[32]，因此需要提前对抗体的各项理化性质以及在不同物种之间的差异性进行分析，以确保抗体经Fc段改造后达到半衰期预期的延长效果。

1.2 pI改造

IgG抗体的pI是其重要的物理性质之一，众多研究证实了通过改变抗体表面所带电荷量及其电荷分布可以改变IgG的半衰期。人们普遍认为通过降低抗体整体的净正电荷来降低其pI值，能够减少抗体与带负电荷的细胞膜之间的非特异性相互作用，从而在一定程度上降低细胞对抗体的摄取速率和抗体的清除速率。除此之外，有研究还发现了IgG Fv区的正电荷斑块会促进抗体与FcRn的结合，使得其在中性pH条件下与FcRn的解离速度降低，从而影响了IgG的PK性质[33-34]。

早期研究者们采用化学偶联法将IgG阳/阴离子化[35-36]，从而引起IgG抗体PK的变化，但运用该方法得到的IgG变体的pI并不完全一致，这导致研究者无法准确地评估IgG自身电荷变化对其半衰期的影响程度。随后，Li等[37]发现在对人源化的抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）IgG的kI/VH3框架区序列进行改造的过程中，因抗体所带负电荷增加而改善了抗体的PK。但这种抗体框架区氨基酸序列变化所引起的抗体pI变化的范围非常狭窄，并且由于结合不同靶标的IgG抗体具有不同的理化性质特征，使得部分人源化IgG的pI值变化后并不引起其半衰期的改变，因此限制了该方面的应用。近年来，越来越多的研究致力于通过改造IgG Fab段来降低IgG的pI值或改变其表面的电荷分布。例如，Igawa等[38]通过对抗白细胞介素6受体（interleukin 6 receptor，IL-6R）IgG的Fab段中的氨基酸进行定点诱变产生pI值比野生型低1 ～ 2个pI单位的IgG变体，使得该变体半衰期延长了2.4倍。Datta-Mannan等[39]则利用分子建模技术将互补决定区（complementarity determing region，CDR）带正电荷的氨基酸残基进行了替换，在不影响抗体整体pI值的条件下平衡了CDR的电荷分布，进而延长了抗体的血清半衰期。但通过改造Fab段来实现IgG的pI值或电荷分布变化的策略可能会同时引起其抗原特异性结合能力减弱或理化性质（稳定性、溶解度和黏度）的改变，而如果严格控制这些影响因素，将会导致筛选出来的能够有效延长IgG半衰期的突变类型十分有限。

1.3 糖基化改造

IgG是人血清中含量最多的糖蛋白，糖基化作为其翻译后修饰的重要生物反应之一，对其半衰期、亲和力、Fc段结构及其效应功能等方面有重要影响。IgG在内质网和高尔基体中发生的糖基化反应主要为Fc段CH2结构域氨基酸残基Asn297上的N-连接糖基化，少数IgG 的糖基化反应发生在Fab段[40]。对IgG的半衰期有影响的聚糖主要包括甘露糖、唾液酸、半乳糖，IgG的N-聚糖结构不会显著影响其与FcRn的结合，但会通过相关受体介导的选择性糖蛋白清除途径来影响其半衰期。例如，肝中的去唾液酸糖蛋白受体可结合IgG N-末端的半乳糖而将IgG清除，甘露糖受体可与IgG N-末端的甘露糖或N-乙酰氨基葡萄糖残基结合并将其清除，另外，IgG N-末端的甘露糖和半乳糖还可通过凝集素介导的清除反应而引起半衰期缩短[41]。

大量研究证实含高甘露糖型的IgG与含其他糖型的IgG相比清除速度更快、半衰期更短[42-43]。Newkirk等[44]和Winkelhake等[45]通过去除N-末端半乳糖以及N-乙酰氨基葡萄糖使得IgG的半衰期明显延长。此外，唾液酸化对IgG在血浆中的半衰期也至关重要，唾液酸糖链的存在极大地增加了IgG所带负电荷的数量，减少了受体介导的内吞作用，从而延长了IgG的半衰期。Ludwig等[46]通过在体系中加入唾液酸前体（1，3，4-O-Bu3ManNac）将抗白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）IgG唾液酸化，结果发现该IgG的半衰期由原来的39.5 h延长至60.9 h，且其生物活性和稳定性没有受到糖基化的影响。Bas等[47]还将IgG Fc段的高唾液酸化与Fc段随机突变相结合，得到的高唾液酸化IgG突变体，经半衰期检测发现，唾液酸化既可直接延长IgG抗体的半衰期，也能与Fc段突变一起协同延长IgG的半衰期。另外，也有研究发现IgG Fab段的唾液酸化可增强抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）IgG单抗（cetuximab）和抗MUC1 IgG 单抗（pankomab）的血清半衰期[48]。

1.4 抗原结合部位pH依赖性改造

IgG除了被细胞非特异性摄取并被胞内溶酶体以降解的方式清除之外，还可以通过与相应抗原特异性结合的方式被免疫细胞内吞并清除。通常与膜抗原结合的抗体会因迅速与抗原一起内化而被快速清除，这种现象被称为靶介导的药物处置（targetmediated drug disposition，TMDD）。为了减少这类抗体的快速清除，一种基于抗原结合部位pH依赖性IgG的工程化技术被提出并受到广泛关注[49-51]，该抗体在血液中与靶抗原结合后被免疫细胞内吞至核内体中，核内体所提供的酸性条件（pH = 6.0）可以降低抗体与靶抗原的亲和力，从而加速抗体与抗原的解离，解离后的抗体可被FcRn介导的循环作用而重新回到血液中，而靶抗原则被运输至溶酶体中被降解，从而在有效降解靶抗原的同时最大限度地减少了TMDD介导的抗体快速清除并延长了抗体半衰期。

最常用的抗原结合部位pH依赖性改造的方法是组氨酸突变[52-53]，即在CDR或骨架区被引入组氨酸，利用组氨酸在酸性核内体中质子化和在中性血液中去质子化的电荷特性实现了其与抗原的解离与结合。但通过表面逐个组氨酸突变来达到改造目的的策略耗时耗力，并且获得的突变型IgG虽然能在酸性pH下减弱与抗原的结合亲和力，但在某些情况下也可能同时降低其在中性条件（pH = 7.4）下与抗原的结合亲和力，从而降低了其对靶标识别能力。对此，研究者们在技术上做了进一步改进。Schröter等[54]通过使用联合组氨酸扫描文库和酵母展示技术的策略筛选并合成了抗原结合部位pH依赖性的抗肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）IgG单抗，所获得的工程化IgG抗体在pH= 6.0条件下与抗原的解离速率常数增加了230 ～ 780倍，但是在pH = 7.4下保持了与抗原的结合活性，并且，这种基于高通量技术开展的组合文库筛选使得工作量大大减少。Bonvin等[55]以1个VH结构域和7个VL结构为基础并在其CDR3处引入足量的组氨酸突变，建立了富含组氨酸的scFv噬菌体库，利用噬菌体展示技术筛选获得与CXC趋化因子配体10（C-X-C chemokine ligand 10，CXCL10）以pH依赖性方式结合的轻链可变区和重链可变区，并将两者重组构成完整的抗CXCL10 IgG1，该IgG1在pH 为6时与CXCL10的亲和力系数比在pH = 7.4时降低了2.4倍，这种“从头筛选”的方法更具有通用性并且提高了筛选过程的效率，之后也被运用到了合成抗原结合部位pH依赖性的抗葡萄球菌肠毒素B IgG和抗EGFR IgG中[56-57]。

1.5 抗原结合钙离子依赖性改造

由于抗体的抗原结合pH依赖性改造始终需要依赖于其组氨酸残基的质子化，该过程发生在酸性核内体中，质子化后的抗体与抗原表位中带正电或质子供体残基之间产生静电排斥，导致抗体与抗原解离，最终使得抗体重新回到血液中。但某些抗体在酸性pH环境下是与抗原带负电荷或成为质子受体的表位相结合的，这将导致抗体即使经过组氨酸改造，也不会产生抗原结合pH依赖性。为了克服这一限制，Hironiwa等[58]探索了一种替代性方法，利用血液与核内体之间钙离子浓度的差异，通过在含钙离子的溶液中将抗体与人IL-6R结合并在无钙离子的溶液中进行洗脱的步骤对人噬菌体抗体库进行筛选，最终筛选得到一种抗原结合部位钙离子依赖性IgG，该抗体可在循环中被重复利用，并且加速了机体对抗原的清除。但是，从人抗体库中筛选出抗原结合部位钙离子依赖性IgG的种类和数量有限，需要更多的研究来提升该技术的普适性。

2 纳米抗体的半衰期改造

2.1 与长半衰期蛋白融合

由于Nb的尺寸较小，在肾滤过屏障的相对分子质量阈值（60000）以下，致使Nb在人体内的半衰期低至几小时甚至几分钟。因此，通过将Nb与一些具有长半衰期的蛋白融合表达形成更大相对分子质量的蛋白成为了延长其半衰期的有效方法之一。人体内具有长半衰期的蛋白主要是人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和IgG，两者的相对分子质量都大于肾滤过蛋白质的相对分子质量阈值，并且IgG的Fc段融合能使Nb直接参与FcRn结合介导药物的胞内循环过程，从而更有效地提升药物的半衰期。

直接与HSA（相对分子质量为66000）连接形成融合蛋白很可能会使Nb失去其小分子优势（高渗透性、高溶解度），因此，研究者们往往采用在Nb上融合能与HSA 结合的小分子蛋白质，如相对分子质量为5000 ～ 6000的白蛋白结合结构域[59]和小于15000的抗HSA Nb[60]。例如，Morais等[61]将白蛋白结合结构域与抗TNF Nb进行了融合，结果发现融合蛋白VHH-Zag（相对分子质量为25200）的24 h血液清除率和总排泄量均显著低于未融合的Nb，从而延长了抗TNF Nb的半衰期；Sato等[62]将抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）Nb（H11）与抗HSA Nb融合形成H11-HLE（相对分子质量为27200），在小鼠体内进行PK实验发现H11-HLE融合蛋白在血浆和肿瘤中的半衰期与H11相比延长了10倍，且H11-HLE保持了与H11相似的抗原结合亲和力。相比较而言，将Nb与Fc段进行融合表达是延长Nb半衰期的主要手段之一，但该方法在延长Nb抗体半衰期的同时还赋予了Nb其他特性，如Li等[63]为了提高抗人蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9） Nb的半衰期以及靶向性，将抗人PCSK9 Nb的二聚体与IgG4的Fc段进行了融合，所获得的融合蛋白不仅半衰期长，而且增强了其稳定性和降脂效果。另外，Nb与IgG的Fc段的融合还可以赋予其Fc相关的效应器功能[如ADCC、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用 （antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP）和CDC]，使得该方法在抗肿瘤药物研发领域被广泛应用[64]，也有研究者通过Nb与二硝基苯酚（di-nitro phenol，DNP）半抗原偶联的方式招募抗DNP抗体，以此来达到相同的效果[65-66]。此外，还有研究者通过将Nb以24聚体的形式结合在铁蛋白表面，构建出了一种新型的纳米抗体铁蛋白-Nb融合蛋白——Fenobody，Fenobody与常规Nb相比具有更强的抗原结合亲和力（约360倍）和更长的半衰期（约10倍）[67]。

2.2 化学修饰

Nb除了通过与上述蛋白质融合来增加相对分子质量以减少肾脏滤过率之外，还能通过一些化学修饰的方式来达到相同的目的。最经典且技术最为成熟的化学修饰是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰[68]。PEG是一种高度韧性、亲水性且不能被生物降解的生物相容性大分子，不仅能够显著改善Nb及其他小分子蛋白质在体内的循环半衰期，还可以降低它们的免疫原性、提高其稳定性和水溶性，因此被美国FDA批准广泛应用于药物的PK改造[69-71]。但PEG修饰也存在一些弊端，比如随机化的PEG修饰会影响Nb的治疗效果[72]、长期使用PEG修饰后的Nb会导致PEG在体内大量堆积而对机体产生毒性作用，并且PEG自身也具有免疫原性，一旦造成机体产生相应抗体，很可能会影响药物的治疗效果或引发其他的不良反应。

为了弥补PEG修饰的缺陷，一些PEG模拟肽开始被广泛应用，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸（prolinealanine-serine，PAS）序列即为其中之一。PAS具有免疫原性低、不会在肾脏积累以及不需要通过复杂的化学偶联反应与蛋白质连接等独特优势，使其在Nb半衰期改造中得到应用。Khodabakhsh等[73-74]首次将PAS重复序列连接至抗VEGF Nb上，使得Nb终末半衰期显著增加了14倍，同时发现PAS在不改变Nb生物活性的情况下，提高了Nb的抗原结合能力并对正常细胞没有表现出任何细胞毒性。另外，作为PEG替代性化合物的XTEN也同样具有良好的安全性和较低的免疫原性，它是一种非结构化的亲水性多肽，能够有效、精准地延长所修饰的肽和蛋白质的半衰期[75]，最初应用于人类生长激素[76]、胰高血糖素样肽2[77]、胰高血糖素[78]和凝血因子[79]等蛋白类治疗性药物的半衰期延长。近年也有研究者将XTEN与scFv融合，构建出一种靶向肿瘤相关抗原[人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor，HER2）或EGFR]和分化簇3（cluster of differentiation 3，CD3）的双特异性T细胞结合剂XPAT，在延长scFv半衰期的同时提高了其抗肿瘤活性和稳定性，并保证了XPAT的安全性[80]。虽然目前还未有研究者对XTEN延长Nb半衰期进行实验探究，但就上述研究可见XTEN应用的广泛性，说明其在Nb半衰期延长领域具有巨大潜力。除此之外，弹性蛋白样五肽（elastin-like pentapeptide，ELP）修饰也被证实在保持Nb的体内生物活性的同时，能减少Nb通过网状内皮系统而被大量清除，从而延长其半衰期，并因其高度的生物安全性而得到广泛应用[81-83]。如Conrad等[84]设计了一种ELP修饰的抗TNF Nb，其在体内的存留时间相对于未修饰的抗TNF Nb延长约24倍，并可以在植物中实现高效表达。

2.3 利用红细胞载体

红细胞（red blood cell，RBC）可以作为许多小分子物质的载体，具有长循环半衰期（120 d）、缺乏细胞核、对机体来说缺乏自身免疫原性、可被机体有效清除并诱导机体对附着于RBC表面的外来物质产生免疫耐受的特性[85]。因此，与化学修饰相比，以RBC作为Nb的载体的方法对机体来说安全性更高。

目前，已经开发了几种连接RBC与Nb的技术。传统的方式是通过借助短肽或化学交联剂将Nb与RBC表面的膜蛋白偶联，但是在RBC上的偶联位点往往缺乏特异性，或者涉及的操作步骤过多，容易使RBC受损而被机体快速识别并清除。为了保护RBC并维持其天然生物学特异性，Huang等[86]开发了一种新的策略，通过基因修饰的方式将抗A型肉毒杆菌神经毒素（botulinum neurotoxin type A，BoNT/A）的Nb的序列与RBC膜上的糖蛋白A（glycophorin A，GPA）嵌合并表达在小鼠RBC表面，在维持RBC正常生理功能的同时使抗BoNT/ANb的半衰期延长至28 d。虽然该方法更为精准，但对祖红细胞进行基因改造的过程十分耗时、昂贵；并且无法保证经体外培养后获得的成熟RBC全部为无核RBC，因此可能在后续实验中造成RBC遗传物质的传播。随后，Harmand等[85]又进行了创新，他们设计了一种突变的天冬酰胺内肽酶（Cys247Ala-OaAEP1），该酶可以识别改造后的Nb上的三肽序列（Asn-Xaa-Yaa，Xaa通常为脂肪族氨基酸，Yaa通常为侧链氨基酸），并催化Nb与RBC之间的连接反应。该方法不仅过程简单、快速，而且对Nb和RBC的正常生理特性均没有较大影响，具有一定的通用性。

2.4 多价纳米抗体

多价Nb是解决Nb半衰期问题的途径之一，通过利用基因重组技术或柔性连接物的方式将相同或不同的Nb组合成一个更大相对分子质量的融合蛋白，同时多价结构也能在一定程度上增强整个融合蛋白的抗原结合亲和力。例如，Sadeghi等[87]将羊驼IgG2c的铰链区序列插入到2个编码抗VEGF Nb的序列中间，形成二价Nb，研究发现该二价Nb在抑制人内皮细胞增殖、成管和迁移方面均明显优于单价Nb，且PK结果表明二价Nb的半衰期比单价Nb长1.8倍； Ma等[88]将编码程序性死亡受体-配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1） Nb和抗T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（T cell immune receptor with Ig and ITIM domains，TIGIT）Nb的基因克隆至含人IgG4 Fc段的载体中，成功构建了四价PD-L1/TIGIT双特异Nb，其相较于单价抗体具有更高的阻断活性。此外，也有研究者利用柔性连接肽Gly-Ser（GS）将3个抗呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）Nb连接成一种抗RSV的三价Nb ALX-0171，其对RSV的中和效力增强了6000倍，且目前已进入Ⅱ期临床试验[89]；Koenig等[90]也利用柔性连接肽（Gly4Ser）3将抗SARS-CoV-2 Nb连接形成二价或三价的抗SARSCoV-2 Nb，其中活性达到单价Nb的100倍以上。柔性连接肽具有灵活性、稳定性等特点，但其缺乏刚性，可能导致融合蛋白表达下降或生物活性丧失，因此，Xiang等[91]同时利用（EAAAK）31刚性连接肽序列将与SARS-CoV-2 刺突蛋白受体结合域中不同表位结合的Nb连接成具有高中和效力的多价Nb。

3 结语与展望

在抗体药物发展历程中，以IgG为主的治疗性单克隆抗体药物因特异性高、半衰期长、安全性好，使其在抗体药物市场中长期占据主导地位。研究者们在不断地挖掘新的药物靶点以研发新型抗体药物的同时，也在通过延长已有的治疗性抗体半衰期的方式来进一步提高其治疗效果。在延长IgG半衰期的相关方法中，针对其Fc区改造的研究最多且最成熟，在临床中应用最为广泛的YTE和LS变体不仅使得抗体的半衰期大大延长，也保护了抗体的抗原识别特性。但在Fc区引入突变，改变Fc与FcRn结合pH依赖性的同时，还需要注意突变对抗体的Fc效应功能、结构稳定性的影响。而针对这些影响，研究者们也通过建立Fc变体库并结合噬菌体展示技术、计算机辅助结构模拟技术、点饱和突变技术等方法获得了更多半衰期延长的Fc突变组合，且不会对IgG的其他功能造成影响。此外，改变IgG的pI或电荷分布也是延长其半衰期的常用方法，通过化学偶联或诱导IgG的氨基酸序列突变使其pI降低或均衡电荷来达到改造目的，但这些方法都存在局限性。而IgG的糖基化改造对理化性质的影响是多方面的，通过降低IgG中的甘露糖、半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖的方式可减少其与一些糖受体结合从而降低其清除率，通过唾液酸化也可延长其半衰期，还有研究者证实联合Fc突变与唾液酸化可以协同增强抗体半衰期。另外，赋予IgG pH依赖性或钙离子依赖性的抗原结合能力可以降低其胞内特异性清除速度，从而改善其半衰期。通常采用在Fab区引入组氨酸的方式来制备pH依赖性抗原结合抗体，但过程中需要特别注意对中性pH下IgG与抗原正常结合的影响。

Nb的半衰期改造是进一步改善Nb药物疗效的重要方向。Nb的半衰期改造策略主要有4种：与长半衰期蛋白融合、化学修饰、利用RBC载体和多价Nb。基于上述策略，目前较为成熟的技术包括人HSA融合、Fc融合、PEG修饰以及多价Nb。Nb直接与人HSA融合可能会导致其小尺寸优势的丢失，因此，许多研究者后来选择将Nb与白蛋白结合域（albumin binding domain，ABD）或抗HAS Nb进行融合；Fc融合在延长Nb半衰期的同时赋予其Fc相关的效应器功能，更有利于Nb应用于抗肿瘤等疾病的治疗；PEG修饰作为最经典且技术最为成熟的化学修饰方法已经在包括Nb在内的多种蛋白质的性能优化上得到应用，但也有研究表明该方法也存在一定安全隐患，由此研究者尝试开发相对分子质量较小的PEG模拟肽。除此之外，利用RBC载体的相关技术也在不断进步并朝着通用化的方向发展。最后，多价Nb也因在延长Nb半衰期的同时增强了Nb的抗原结合能力而得到应用。

总之，IgG和Nb的相关半衰期改造技术各有优劣，而且，各种治疗性抗体自身性质以及与相应抗原结合的表位结构的差异也会导致抗体药物半衰期差异较大。因此，治疗性抗体半衰期改造并没有一个通用的最佳策略，需要结合有关性质进行合理选择。同时，不同改造技术的相互结合也可以作为一种新的策略来协同提高抗体药物的半衰期。在未来的研究中，随着人工智能（artificial intelligence，AI）技术和深度学习技术的不断迭代，使其在结构生物学方面得到广泛的运用，促使更多蛋白晶体结构得到了更深层次的解析，我们将更加全面的了解IgG和Nb抗体的结构及其效应功能，因此，基于AI的结构预测算法将会使得抗体药物半衰期的改造迈入更加快速、精准和科学的轨道。