水合氧化物对抗生素抗性基因水平转移的影响

李晓佳,刘 思,王婷婷,秦 超,胡小婕,高彦征(南京农业大学,土壤有机污染控制与修复研究所,江苏 南京 210095)

抗生素抗性基因(ARGs)是一种新型环境污染物,普遍存在于水、土壤、大气中.其在环境中的广泛传播,易导致多重耐药致病菌产生,进而危害人类健康.ARGs 在环境中传播的主要方式包括垂直基因转移和水平基因转移.由于水平基因转移可以实现基因在同种和不同种属菌株间的传递,因此对于ARGs 在环境中的扩散与传播具有更加重要的影响,这也是细菌获得耐药性的主要方式之一[1-2].ARGs水平转移方式主要有接合、转化和转导.其中,接合和转导针对细胞内的DNA,而转化则允许细菌同化胞外的DNA.与胞内DNA 相比,胞外DNA 更易受到外部环境影响,因此,了解ARGs 的转化过程对于控制它在环境中的传播具有重要意义.

土壤是人类生产、生活的重要资源,也是ARGs主要受纳体之一.ARGs 在土壤中的传播与扩散受到多种生物和非生物因素影响.现有研究发现环境中的污染物如离子液体[3]、重金属[4]、有机化合物[5]等均能对ARGs 的转移产生影响.金属氧化物是土壤矿物的重要组成部分,主要包括铁氧化物、铝氧化物、锰氧化物等,水合形式是其存在的重要形式.在高度风化的土壤中,水合氧化物最高可占据土壤总重的50%[6].这些土壤氧化物在不断变换的地表环境中长久地经历各种复杂过程,通常具有比表面积大、表面性质活泼、带有两性电荷等性质,对于许多物质具有很强的吸附能力,拥有与土壤中重金属离子、有机污染物、DNA、细菌等多种生物和非生物物质相互作用的潜能,这也为其影响ARGs 水平转移提供了可能.

一方面,土壤水合氧化物能够与DNA 发生结合.由于脱氧核糖-磷酸链处于DNA 双螺旋结构外侧,环境中DNA 分子表面通常呈现负电性.而土壤水合氧化物多携带正电荷,其具有与DNA 相互结合的可能.现今,学者们在此方面已经有所发现.Cai等[7]和Saeki 等[8]分别发现针铁矿和三水铝石对鲑鱼精DNA 具有不同程度的吸附能力,吸附量分别达到3.5mg/g与5.4mg/g.另一方面,土壤水合氧化物活泼的表面性质,使其具有易吸附于细菌表面的特性.其可通过静电作用、化学成键、配位鳌合、离子交换等方式结合于宿主细胞包膜上,引起细菌生理生化改变,具体表现为细菌胞内活性氧自由基(ROS)水平、细胞膜通透性、细胞形态、相关mRNA表达情况等发生变化.已有研究表明,三水铝石可通过静电作用、化学成键作用黏附于细菌表面[9];针铁矿能够促使致病菌胞内ROS 大量生成,不仅抑制了其蛋白质合成,还破坏了细胞膜完整性,进而显著抑制细菌生长[10].由此可见,土壤中水合氧化物可与细菌相互作用并影响其生理生化与存活.结合土壤水合氧化物与DNA 的相互作用,不难窥见土壤水合氧化物充分具有影响ARGs 以转化形式进行水平转移的可能性.

基于此,本文以负载于pUC19 质粒的氨苄青霉素抗性基因为代表性胞外ARGs,以大肠杆菌作为受体细胞,研究土壤中比较常见、具有代表性的两种水合氧化物(水合铝氧化物与水合锰氧化物)对ARGs转化的影响.同时,分别分析了水合氧化物与DNA及受体细胞的相互作用,以揭示其影响ARGs 转化的机制.该研究将有助于增进人们对环境中抗生素耐药性传播的认识.

1 材料与方法

1.1 实验材料

四水硝酸锰( Ⅱ)、无水氯化铝购于南京晶格化学科技有限公司.抗性质粒pUC19 购于Takara 生物科技(中国)有限公司,浓度为0.5μg/μL,被溶解于含有10mmol/L Tris-HCl(pH 为8)及1mmol/L EDTA 溶液中.革兰氏阴性菌大肠杆菌E. coli DH5α 感受态细胞(Trelief™ 5α Chemically Competent Cell)购于擎科生物科技(北京)有限公司.氯化钠(NaCl)、蛋白胨、酵母提取物(生物可用级别)购自于Oxoid(英国)有限公司.琼脂粉、氨苄西林钠盐购自于Solarbio 科技(中国)有限公司.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)购自凯基生物技术股份(南京)有限公司.超纯水通过Milli-Q 梯度系统获得(电导率18.2MΩ×cm)(贝德福德,MA,美国),此水被用于本文所有实验.

1.2 研究方法

1.2.1 水合氧化铝与水合氧化锰合成 分别将5g NaOH、5.56g AlCl3固体加入250mL 水中制得0.5mol/L NaOH 溶液和0.5mol/L AlCl3溶液.然后将NaOH 溶液加入AlCl3溶液中,快速搅拌,并调节pH=7.0.室温陈化48h,离心,弃去上层清液.用去离子水反复漂洗离心6 次,至上层清液pH=7.0,沉淀透析16h 以除去多余离子.洗涤后的沉淀物在25℃风干,用研钵和研杵轻轻研磨,过60 目筛并收集粉末.

分别将18.83g Mn(NO3)2·4H2O、7.95g KMnO4、4g NaOH 固体溶解于250mL 水中配成0.3mol/L Mn(NO3)2溶液、0.2mol/L KMnO4溶液和0.4mol/L NaOH 溶液.将KMnO4溶液缓缓加入NaOH 溶液中制得碱性KMnO4溶液,再将Mn(NO3)2溶液与碱性KMnO4溶液充分混合,此时Mn(NO3)2、KMnO4和NaOH 混合的摩尔比为3:2:4.所得沉淀清洗数次并重新分散于NaNO3溶液中,调节pH 值等于7,老化16h.用去离子水反复漂洗离心,沉淀透析16h,以除去多余离子.洗涤后的沉淀物在25℃风干,用研钵和研杵轻轻研磨,过60 目筛并收集粉末.

1.2.2 水合氧化物组成及表面性质 本实验采用X 射线衍射仪(XRD;布鲁克D2PHASER)对样品进行分析.实验采用铜靶,扫描速度2°/min,扫描角度0～80°.采用扫描电镜(SEM)观察样品的表面形貌和颗粒尺寸.将样品置于铜网并做喷金处理,后用SEM(S-3400N,Hitachi,日本)进行观察.以水为分散剂,采用纳米粒度及 Zeta 电位分析仪(Malvern Zetasizer Nano ZS90 )测定两种水合氧化物的粒径大小及Zeta 电位.

1.2.3 ARGs 转化实验 将两种水合氧化物配制为1g/L 储备液并超声、分散1h,后将储备悬浮液稀释至系列浓度以备后续实验.将25ng pUC19 质粒加入上述水合氧化物稀释液中,并将混合物转移至装有100μL E. coli DH5α 感受态细胞的离心管中(水合氧化物终浓度为0～200mg/L),25℃、200r/min 条件下反应5h.每个处理设置3 个平行.随后将所有装有质粒-感受态细胞混合物的离心管轻轻摇匀,取出后将其置于37℃水浴中5min,并即刻放入冰水浴5min.最后向离心管中加入LB 液体培养基,使最终体积为1mL,在37℃、转速150r/min 条件下复苏培养1h.

采用抗生素筛选平板进行转化效率/频率测定.将100μL 上述菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基平板上,以确定转化子个数.将另一份100μL 上述菌液涂布于未含任何抗生素平板上,以确定宿主细胞存活个数.涂布完成后,将平板正向放置30min,随后倒置放入37℃培养箱中培养20h.最后,计算平板菌落数以确定转化子个数.

为考察水合氧化物析出离子的影响,将 0～200mg/L 水合氧化物悬液加入无菌水,避光、置于25℃、200r/min 摇床中5h,离心使水合氧化物与上清液分离.利用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)检测上清液中离子种类及浓度.取上清液与25ng 质粒混合,并转移至感受态细胞悬液,作用5h 后,按上述步骤进行转化实验.

按下列公式计算ARGs 转化效率、转化频率:

将所得数据通过Origin 软件作图以表明可存活的大肠杆菌数、转化子、转化效率、转化频率随水合氧化物浓度增加的变化.并采用SPSS 软件进行单因素方差分析(ANOVA)、LSD多重比较法和Duncan新复极差法对各变量进行显著性检验,以0.05 为显著性水平,比较各组不同浓度的水合氧化物作用下存活的大肠杆菌数、转化子、转化效率、转化频率与对照组之间的显著性差异,并在图中进行标注.

1.2.4 水合氧化物与DNA 的相互作用 利用原子力显微镜(AFM)观察质粒与两种水合氧化物结合前后的形态.将100ng质粒与200mg/L的水合氧化物混合制成200μL 混合体系,在25℃条件下反应5h 后,将10uL 样品溶液滴至云母片表面,并在25℃下使其自然干燥.质粒样品图片通过 Multimode 8AFM(Bruker,德国)原子力显微镜获得.

分析水合氧化物与质粒DNA 结合位点.将2mg质粒DNA 与100mg/L 水合氧化物混合制成5mL 混合体系,在25℃条件下反应5h后,放入冷冻干燥仪进行干燥.所获样品利用Nicolet NEXUS870 傅里叶红外光谱(FTIR)仪获取其对应光谱,并通过谱图分析两者结合位点.

1.2.5 水合氧化物对宿主细胞膜通透性的影响大肠杆菌-水合氧化物(0～200mg/L)混合液在25℃条件下反应5h 后,与PI 染料进行混合,随后在25℃、黑暗环境中孵育30min.最后,细菌发出的红色荧光由流式细胞仪(BD Accuri C6)进行测定,测量时激发波长设定为480nm,每组共检测10000 个细胞,并使用Flowjo 软件对数据进行分析.

采用 SPSS 软件进行单因素方差分析(ANOVA)、LSD 多重比较法和Duncan 新复极差法对各变量进行显著性检验,以0.05 为显著性水平,比较不同水合氧化物浓度下细胞膜通透性水平的显著性差异,并采用 Origin 软件作图.

2 结果与讨论

2.1 水合氧化物材料表征

2.1.1 XRD 表征 对实验制得的水合氧化铝和水合氧化锰进行XRD 表征,XRD 谱图如图1(a)所示.水合氧化铝分别在衍射角为40.0°和65.6°处显示了两个较为明显的衍射峰,该谱图与文献报道的水合氧化铝出峰位置一致[11].水合氧化锰在衍射角为37.3°和66.7°时均出现了衍射峰,该样品的衍射峰峰形完整、窄而尖锐、相对强度较高,未观察到其它明显杂质衍射峰出现,该谱图符合水合氧化锰(δ-MnO2)特征[12].

图1 水合氧化物表征Fig.1 Characterization of hydrous oxides

2.1.2 水合氧化物基本形貌表征 现有研究表明,环境温度、作用时间和pH 值等多种因素均能够对水合氧化铝的形成速度和种类产生影响[13-17].已有研究发现,当温度上升至150℃时,其水合产物中薄水铝石(AlOOH)比三水铝石更加稳定[17].不同水热条件下合成的水合氧化铝类型相异,即亚稳态的氧化铝多晶在水介质中可发生相变[18-21],目前已知的水合氧化铝结晶相至少有7 种[22].类似地,水合氧化锰的形成也与不同的反应时间和环境条件密切相关.李娜[23]指出,氧化锰存在至少30 种不同的晶体结构,不同的反应条件下可制备出晶格结构、表面形貌、比表面积不同的氧化锰类型.其中,δ-MnO2是典型的水合氧化锰晶体,其层间距中除了碱金属离子之外,还含有封闭的水层.由此可见,不同水合方式与水合条件下形成的水合氧化物形貌也各有不同.在本实验条件下,水合氧化铝多为较小块状,具有一定的不规则性;而水合氧化锰则呈现为较为均匀的颗粒状(图1(b)).

2.1.3 粒径及Zeta 电位表征 对实验制得的水合氧化物进行粒径及Zeta 电位表征,结果如表1 所示.水合氧化铝的粒径为(449.43±13.86)nm,水合氧化锰的粒径为(350.27±2.38)nm.此外,Zeta 电位反映了颗粒表面电荷种类和密度,是衡量悬浮液体系中胶粒凝聚稳定性的重要指标.两种水合氧化物均显示为正电位,Zeta电位相近且均不超过30mV,这表明颗粒间电荷排斥力较小,在水中较易发生团聚.多分散系数(PDI)可反映粒径分布的均一程度,PDI 指数越小,则样品粒度分布越均匀.通过分析PDI 数据可知(表1),实验所制的水合氧化铝PDI 较高(PDI>0.3),即分子量分布较宽,均匀性较差;相反,水合氧化锰的分子量分布较为均匀,均一性更好,这与SEM 表征结果一 致.

表1 水合氧化物的粒径及Zeta 电位Table 1 Particle sizes and Zeta potentials of hydrous oxides

2.2 水合氧化物对ARGs 水平转移的影响

为探究水合氧化物对ARGs 水平转移的影响,将土壤矿物材料配置成系列浓度(0～200mg/L)溶液进行转化实验,结果如图2 所示.总体上,两种水合氧化物均未显著抑制大肠杆菌存活,可培养的大肠杆菌个数仅在100 和200mg/L 水合铝氧化物处理下略有降低.两种水合氧化物均导致转化子个数、转化效率和转化频率降低.与对照组ARGs转化频率相比,50mg/L 水合氧化铝处理下转化频率开始出现显著变化,而≥2.5mg/L 水合氧化锰即可显著抑制ARGs 转化.在200mg/L 水合氧化铝处理下,转化效率和转化频率分别降至 3.39×104CFU/μg 和0.006,其中转化频率相比于对照组降低了79.44%.在200mg/L 水合氧化锰处理下,转化效率和转化频率分别降至33.11×104CFU/μg 和0.014,其中转化频率相比于对照组降低了57.64%.这表明,水合氧化铝和水合氧化锰均抑制了ARGs转化过程.

图2 水合氧化物对ARGs 转化的影响Fig.2 The effect of hydrous oxides on the transformation of ARGs

2.3 水合氧化物析出金属离子及其对ARGs 水平转移的影响

现有研究表明,土壤水合氧化物溶于水时,可能会析出一定量的金属离子.而土壤中游离态金属离子会对同一环境中的ARGs 污染产生影响.一方面,重金属(Cu2+、Ag+、Cr6+、Zn2+、Cd2+)[4,24-25]等可通过导致细胞内ROS 产生、增加细胞膜通透性、改变mRNA 基因表达等机制促进ARGs 水平转移;另一方面,重金属可以通过协同选择和交叉选择使ARGs 丰度提升[26].

为明确水合氧化物析出的金属离子是否是其抑制ARGs 转化的原因,本实验首先测定了0～200mg/L 水合氧化物析出的离子浓度.结果表明(图3(a)),在供试范围内,随着水合氧化铝浓度的升高,其析出的Al(III)呈现明显上升趋势,200mg/L 水合氧化铝析出的Al(III)高达3299.38μg/L.而对于水合氧化锰,随着其浓度升高,溶液中Mn(II)浓度总体上在0～4μg/L 区间内上下浮动,几乎可以忽略不计.

图3 水合氧化物析出离子及其对转化的影响Fig.3 Metal cations released from hydrous oxides and its impact on transformation of ARGs

有学者指出,水溶液中Al(III)可引起DNA 团聚[27],这可能会降低游离ARGs 进入受体细菌胞内的效率.为进一步探查析出Al(III)对ARGs 转化的影响,收集0～200mg/L 水合氧化铝析出的Al(III)溶液进行转化实验.如图3(b)所示,随着Al(III)浓度的升高,可培养大肠杆菌数增加;相反的,ARGs 转化子个数、转化效率和转化频率呈现下降趋势.在200mg/L 水合氧化铝析出的Al(III)处理下,转化效率和转化频率由18.72×104CFU/μg 和0.010 分别降至2.83×104CFU/μg 和0.001,其中转化频率相比于对照组降低了88.15%.由此可见,水合氧化铝析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平转移的因素之一.本实验结果表明,Al(III)并未抑制大肠杆菌存活,其对ARGs转化的影响并非通过抑制大肠杆菌细胞活性导致,具体机理仍需结合进一步实验分析.

2.4 水合氧化物与抗性质粒的相互作用

为进一步探究水合氧化物与DNA 的相互作用,通过AFM 观察质粒DNA 与高浓度(100mg/L)水合氧化物溶液作用前后形态变化.如图4(a)所示,未添加水合氧化物的对照组中DNA 呈丝状、以独立个体形式存在.而在添加100mg/L 水合氧化物的处理组中,质粒与水合氧化物发生交缠,形成大尺寸结合物(直径约为60～80nm;图4(a)中的亮白点),难以观察到单个丝状DNA.这些大尺寸质粒-水合氧化物结合体导致抗性质粒及其携带的ARGs 难以进入胞内,进而阻碍了ARGs 的水平转移.除水合氧化物本身与DNA 的结合外,水合氧化铝析出的Al(III)也会导致质粒发生团聚(图3(a))[27].

图4 水合氧化物与质粒DNA 的相互作用Fig.4 Interaction between hydrous oxides and plasmid DNA

通过分析水合氧化物暴露前后pUC19 质粒的红外光谱变化,确定水合氧化物在质粒上的结合位点.图4(b)中的结果进一步证实了DNA 与水合氧化物之间发生了相互作用.对于未与水合氧化物反应的质粒DNA,可识别的红外光谱特征峰对应于磷酸基团中P-O 拉伸振动位于1061.3cm-1,PO2-不对称拉伸振动位于 1228.7cm-1[28].位于 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1的振动峰分别归属为质粒碱基胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)[28].与对照组相比,加入水合氧化铝后的 DNA,在1061.3cm-1处的吸收峰偏移到了1058.5cm-1,而加入水合氧化锰后的DNA 在该处则没有发生吸收峰的偏移;水合氧化铝和水合氧化锰加入后,DNA 在1228.7cm-1处的振动峰分别偏移到了1223.0 和1230.1cm-1,这表明两种水合氧化物都可通过磷酸基团与DNA 结合.

而加入水合氧化物后的DNA 在1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1这4 处的振动峰也发生了不同程度的偏移.其中,加入水合氧化铝后 DNA 在1481.9cm-1处的振动峰没有偏移;而在1604.1,1653.5,1688.9cm-1处的振动峰则分别偏移到了 1601.6,1646.4,1686.4cm-1.这表明,pUC19 质粒还可通过碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤与水合氧化铝发生结合,而胞嘧啶与水合氧化铝未发生结合.而加入水合氧化锰后的 DNA, 在 1481.9,1604.1,1653.5,1688.9cm-1处的振动峰分别偏移到了1483.3,1601.6,1650.6,1693.8cm-1,这表明,pUC19 质粒可通过4 种碱基与水合氧化锰发生结合.

2.5 大肠杆菌细胞膜通透性的变化

除了与DNA 发生相互作用外,水合氧化物也具有与宿主细胞发生相互作用的潜能.现有研究表明,金属氧化物以及金属离子可通过改变宿主细胞膜通透性、引起细胞膜损伤、影响胞内ROS生成等,使ARGs 转化频率发生不同程度的改变.例如,纳米Al2O3可造成大肠杆菌E. coli DH5α 细胞膜形成纳米孔洞,有助于携带ARGs 的质粒pBR322 进入细胞并表达其抗性[29].在本实验中,水合氧化物及其析出的金属离子具有影响宿主细胞膜通透性的理论可能.因此,本实验采用PI 染色法、借助流式细胞仪进一步探究了水合氧化物作用下宿主细胞膜发生的变化.

荧光染料PI 是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂,当细菌细胞通透性发生改变,PI 染料可穿过细胞膜嵌入胞内DNA 双链释放红色荧光,该红色荧光强度可反映细胞膜通透性的大小.在本实验中,当大肠杆菌细胞膜通透性提升时,细菌发出的荧光强度则更强,其对应的出峰位置向右偏移;当大肠杆菌细胞膜通透性减弱时,其对应的出峰位置向左偏移.不同浓度水合氧化物作用下细胞膜通透性变化如图5 所示.在0～100mg/L 水合氧化铝作用下,随着水合氧化铝浓度升高,宿主细胞发出的荧光强度并未出现显著变化,对应出峰位置未发生明显偏移,即细胞膜的通透性未显著改变,仅在200mg/L 的水合氧化铝作用下宿主细胞的荧光强度有所上升.然而,水合氧化锰暴露下细胞荧光强度显著下降,对应出峰位置左移,细胞膜通透性变弱.减弱的细胞膜通透性将降低宿主对ARGs 的摄入,进而使ARGs 水平转移频率降低(图2(b)).

图5 水合氧化物对宿主细胞膜通透性的影响Fig.5 The effect of hydrous oxides on the membrane permeability of recipient cells

值得注意的是,水合氧化锰对宿主细胞膜通透性产生抑制效应的原因可能与其在水溶液中的团聚有关,这些团聚体易包裹细菌,阻碍细菌与外界环境的有效接触,增强细胞膜的屏障作用,进而导致细胞膜通透性减弱.对于水合氧化铝颗粒,尽管其团聚体也在一定程度上占据了细胞膜的部分位置,但其析出的浓度较高的Al(III)被证明可以引发细胞内ROS 过量产生[30],这会导致细胞膜通透性提升,进而可能抵消了由水合氧化铝团聚体包裹引发的对宿主膜通透性的抑制效应.因此,对于水合氧化铝,未观察到显著的膜通透性变化.

3 结论

3.1 水合氧化铝与水合氧化锰对胞外ARGs 水平转移均具有抑制作用,且抑制程度受其浓度调控.200mg/L 水合氧化铝处理下,转化频率相比于对照组降低了79.44%;在200mg/L 水合氧化锰处理下转化频率相比于对照组降低了57.64%.

3.2 水合氧化铝析出的Al(III)是其抑制ARGs 水平转移的因素之一.200mg/L 水合氧化铝析出Al(III)高达3299.38 μg/L,该浓度的Al(III)作用下,转化频率相比于对照组降低了88.15%.而水合氧化锰未有明显Mn(II)析出.

3.3 两种水合氧化物均对质粒DNA 具有吸附作用,能够引发大尺寸DNA-水合氧化物结合体的形成,这是其抑制ARGs 水平转移的原因之一. pUC19 质粒可通过磷酸基团以及碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤与水合氧化铝发生结合;通过磷酸基团以及4种碱基与水合氧化锰发生结合.

3.4 水合氧化锰显著降低了宿主细胞膜通透性,这也是其抑制ARGs 水平转移的因素之一.