畜禽粪便好氧堆肥过程中抗生素的消减规律

周 贤,王 建,韩 进,徐鹏程,凌婉婷*(.南京农业大学,土壤有机污染控制与修复研究所,江苏 南京 0095；.江苏省环境工程技术有限公司,江苏 南京 009)

抗生素作为抗菌剂和生长促进剂被广泛用于畜牧业[1-3].我国作为抗生素最大生产和消费国,畜禽养殖业中抗生素年用量已达8.4 万t[4].然而,这些药物无法被动物体完全吸收代谢,约85%抗生素会以母体形式通过动物粪尿排入环境[5].大量研究表明,畜禽粪便中抗生素种类繁多,其残留量一般在μg/kg级,甚至高达mg/kg 级[5-7].研究发现[6],在36 个养殖场的猪粪中检测出14 种不同种类的抗生素,其含量为0.01～5.2mg/kg.当前全球畜禽粪便排放量巨大.据估算,欧美国家每年约有11～16 亿t 畜禽粪便产生,而中国每年动物粪便产生量高达38亿t[8].目前,畜禽粪便的主要处理途径仍是作为有机肥还田.如此高剂量的抗生素必然会随畜禽粪便农用进入土壤环境,在土壤中积累,从而影响土壤微生物群落结构[9]、诱导微生物产生耐药性[10]、抑制或增强微生物代谢[11-12],给生态环境及人群健康造成潜在的威胁.因此,如何去除畜禽粪便中的抗生素残留,实现畜禽粪便资源化和无害化利用,已成为当前农业生态领域亟需解决的问题.

好氧堆肥法是处理畜禽粪便的主要方法.它利用各种微生物的活性对粪便中有机物质进行分解并产生稳定的有机或无机物作为最终产物,从而达到对畜禽粪便的资源化和无害化处理[13].研究表明,好氧堆肥可去除粪便中抗生素残留[14-15].例如,好氧堆肥后,粪便中氟喹诺酮类抗生素和土霉素可被完全去除[14],强力霉素和磺胺类抗生素的去除率高达80%[15].然而,这些研究只针对一种或两三种抗生素进行研究.到目前为止,人们对大多数抗生素在堆肥过程中的消减情况知之甚少.

本文采用鸡粪、牛粪和猪粪为堆肥原料,着重研究畜禽粪便好氧堆肥过程中15 种磺胺类(SAs)、13种氟喹诺酮类(FQs)和4 种四环素类(TCs)共32 种常见抗生素含量的动态变化,分析粪便中抗生素含量与堆肥时间、粪便特性(如来源、组成、含水量)、供氧频率(翻堆次数)等的关系,系统阐释好氧堆肥后畜禽粪便中抗生素的污染特征,为抗生素风险防控提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试抗生素及堆肥原料

本试验共检测了15 种磺胺类抗生素(SAs,磺胺嘧啶[SD]、磺胺二甲基嘧啶[SM2]、磺胺氯哒嗪[SPD]、磺胺甲噁唑[SMZ]、磺胺甲氧嗪[SMP]、磺胺对甲氧嘧啶[SMD]、磺胺间甲氧嘧啶[SMM]、磺胺噻唑[ST]、磺胺间二甲氧嘧啶[SDM]、磺胺甲噻二唑[ST2]、磺胺苯吡唑[SPP]、磺胺脒[SG]、磺胺醋酰钠[SA-Na]、磺胺邻二甲氧嘧啶[SDM’]和磺胺喹噁啉[SQ]),13 种氟喹诺酮类抗生素(FQs,诺氟沙星[NOR]、氟罗沙星[FLX]、司帕沙星[SPA]、奥比沙星[ORB]、恩诺沙星[ENR]、达氟沙星[DFX]、培氟沙星[PEF]、二氟沙星[DIF]、环丙沙星[CIP]、沙拉沙星[SAR]、洛美沙星[LOM]、氧氟沙星[OFL]和氟甲喹[FLM])和4 种四环素类抗生素(TCs,四环素[TC]、土霉素[OTC]、金霉素[CTC]和多西霉素[DOC]),这32 种目标抗生素标准品均购自美国Sigma 公司,纯度大于98%,其理化性质如Zhou 等[5]介绍.质谱级甲醇和乙腈购自美国Thermo Fisher 科技公司,其他分析级化学品购自国药化学试剂公司,实验用水均为超纯水.

堆肥原料为新鲜的牛粪、猪粪和鸡粪,分别采自南京及其周边地区规模化奶牛、生猪和蛋鸡养殖场[17].堆肥初始物料理化性质见表1.

表1 堆肥初始物料理化性质Table 1 Physicochemical properties of raw materials

1.2 试验设置

本试验在南京农业大学玻璃温室中进行,堆肥共设6 个处理,分别为2 个鸡粪堆肥、1 个猪粪堆肥和3 个牛粪堆肥,具体处理见表2.

表2 堆肥处理方案Table 2 Protocols of composting treatment

根据《畜禽粪便堆肥技术规范》(NY/T 3442-2019)[16],选择稻壳为辅料,将稻壳粉碎成1～2mm,分别与鸡粪、猪粪和牛粪混合均匀,使堆肥初始C/N 为30:1.将6 种处理组的初始含水率调整为55%左右.其中向鸡粪堆肥中加入适量的超纯水,使初始含水率为68%左右,使其成为高含水率鸡粪堆肥处理组(表2).试验采用开放式堆肥,将6 种粪便堆制成锥形(0.5m×0.5m×0.8m),按不同频次进行人工翻堆,为堆体提供充足的氧气.堆肥过程中表面覆盖塑料膜以防止水分过量蒸发.在每个堆体的中心使用自动数字温度计测量每天的温度(上午9:00 和下午15:00),同时测定室温,猪粪、牛粪和鸡粪堆肥温度变化如韩进等[17]所示.

1.3 堆肥样品采集

堆肥32d 后,当所有处理组的温度达到与环境温度25℃接近时,终止观察.收集和分析堆肥第1,2,4,8,16,32d 的样品.按四分法在堆体的上、下、左、右、中位置进行取样,混合均匀后组成一个样品(1kg).样品保存于-80℃用于抗生素检测.

1.4 抗生素检测方法

根据Zhou 等[5]描述的方法从堆肥样品中提取目标抗生素,通过API 5000 三重四极杆质谱仪在电喷雾电离模式下对抗生素进行检测分析.所采用的分析方法线性相关性良好(r>0.9995).堆肥样品中所选抗生素的最低检出限为0.5～10μg/L.

1.5 统计分析

不同类型粪便堆肥过程中,抗生素含量随时间的变化趋势,用一级动力学方程进行拟合:

式中: c 指堆肥某一时间测得的抗生素含量,μg/kg;c0指堆肥开始(第1d)时抗生素含量,μg/kg;k 为抗生素降解速率常数,d-1.

不同类型粪便堆肥过程中,抗生素半衰期公式如下:

式中:t1/2为半衰期,d.

数据经Excel 2020 预处理后用IBM SPSS Statistics 22 单因素方差分析(One-way ANOVA)中的最小显著性差异法(LSD)进行不同处理间各项指标的显著性差异检验.P<0.05 视为统计学上具有显著性差异.对于两个处理组间的比较采用独立样本T检验(置信区间95%)进行分析比较.其中,*为P<0.05统计学上具有显著性差异.最后采用Origin 2018 软件作图.

2 结果与分析

2.1 畜禽粪便中抗生素残留特征

表3 反映了新鲜鸡粪、猪粪和牛粪样品中抗生素种类及含量特征.如表3 所示,SAs、FQs 和TCs均在3 种粪便中检出.其中,SAs 的检出率为31.1%,低于粪便中FQs(56.4%)和TCs(91.7%)的检出率,说明FQs 和TCs 是3 种粪便中主要抗生素种类.然而,SAs 的总量(干物质计)为119.09μg/kg,高于TCs和FQs 在粪便中的总含量.并且SAs 的平均含量(干物质计)范围为ND～49.65,而FQs 和TCs 平均含量范围为n.d.～13.2,n.d.～20.95μg/kg.这说明尽管SAs检出率低,但其在粪便中总含量高且含量范围跨度较大.

表3 3 种畜禽粪便堆肥前后抗生素含量(µg/kg 干物质计,平均值±标准差,n=3)Table 3 The antibiotic concentration(µg/kg dry matter, mean±standard derivation, n=3) in three kinds of livestock manures before and after composting

不同种类粪便中抗生素种类和含量存在差异.在3 种粪便中,牛粪中抗生素检出率最低,且总含量较低,为67.76μg/kg.猪粪和鸡粪中抗生素检出率和总含量相当.对于3 种类型的抗生素,牛粪中SAs 检出率较低,为6.67%.而鸡粪中SAs 的检出率较高,为53.3%,且其总含量在3 种粪便中最高,为72.43μg/kg.其中,SPP 在鸡粪中含量最高为49.65μg/kg.FQs 和TCs 在3 种粪便中的检出率及总含量相当,但FQs组成存在一定差异.其中PEF、CIP、SAR 和OFL 均在粪便中检出.上述结果表明不同种类粪便中抗生素种类和含量存在一定差异.

2.2 畜禽粪便堆肥过程中抗生素残留动态变化

3 种畜禽粪便堆肥温度变化分为升温期、高温期和降温期3 阶段[17].在堆肥第3d,堆体温度上升至50℃ ,维持到第16d 后下降,并逐渐接近环境温度.这一过程符合《粪便无害化卫生标准》(GB 7959—2012)[35]中对堆肥温度的规定,即堆肥温度(≥50 ℃)需保持一周以上.显然,本文中3 种畜禽粪便均满足高温堆肥要求.表3 反映了堆肥前后抗生素残留变化情况.经32d堆肥后,3种粪便中抗生素总含量分别由67.76,107.32 和123.09μg/kg 下降至8.12,23.51 和11.91μg/kg,其去除率高于78.09%.并且粪便中抗生素的检出率分别由40.62%、53.12%和53.12%降低至28.12%,31.25%和25%,表明好氧堆肥可有效减低粪便中抗生素含量及种类.

此外,堆肥过程对不同种类抗生素的去除效果存在差异.堆肥后,3 种粪便中SAs 的检出率分别由6.67%,33.33%和53.33%下降至0%,6.67%和13.33%.同时,除鸡粪中ST2 去除率较低外,其余被检出的SAs 去除率均高达90%,说明高温好氧堆肥可有效去除畜禽粪便中SAs.堆肥结束后FQs 和TCs 的去除率高达62.81%,但检出率较高.与堆肥前检出率相比,堆肥后牛粪和猪粪中仍有5 种FQs 被检出,而TCs 的检出率仍为100%.同时,堆肥对OFL 和CTC的去除率均低于50%,说明堆肥可有效降低畜禽粪便中FQs 和TCs 残留,但不能完全去除.

2.3 不同类型粪便堆肥过程中抗生素消减效果

如图1 所示,在相同的堆肥处理过程中,随着时间的延长,粪便中各类抗生素含量逐渐降低.不同种类粪便中抗生素的残留率存在显著差异(P<0.05).与鸡粪和猪粪相比,32d 堆肥后,牛粪中抗生素已低于检出限≤0.5 μg/L,表明牛粪中抗生素可通过堆肥被去除.对于鸡粪堆肥,除SAs 外,鸡粪中FQs 和TCs 残留率随时间的延长缓慢下降.经32d 堆肥后,鸡粪中FQs 和TCs 的总残留率高达59.57%和81.32%.同样地,猪粪堆肥32d 后,FQs 和TCs 的总残留率分别为32.90%和35.31%.并且猪粪在堆肥前期消减速率较快.堆肥第2d,FQs 和TCs 的去除率分别为40.38%和39.92%.随着时间的延长,堆肥第8d 后,FQs 和TCs消减速率趋于平缓.综上,堆肥对不同种类粪便中抗生素的去除存在显著差异,牛粪中抗生素残留更易通过堆肥去除.

图1 不同种类粪便堆肥过程中抗生素残留率变化Fig.1 Residual rate(%) of antibiotics during composting process

2.4 不同堆肥处理方式对抗生素消减的影响

研究表明,抗生素在堆肥过程中的消减可能与堆肥样品C/N、TOC、湿度、温度和氧气等环境变量有关[13].为此,本研究考察了堆肥初始含水率及堆肥过程中翻堆频率对抗生素消减的影响.图2 所示,经过32d 堆肥处理,低含水率鸡粪中SAs、FQs、TCs 和总抗生素的残留率分别为7.10%、59.57%、81.32%和45.90%,高于高含水率鸡粪堆肥后的残留率.通过对堆肥过程中抗生素消减速率拟合(表4),发现不同含水率鸡粪堆肥过程中各类抗生素含量变化符合一级降解动力学拟合模型,其R2>0.63.同时,高含水率鸡粪SAs、FQs、TCs 和总抗生素的降解速率常数分别为 0.3293,0.0229,0.0669,0.2739d-1,高于低含水率条件下各类抗生素的降解速率(表4),表明较高的初始含水率(68.11%)有利于加快抗生素的消减.

图2 不同初始含水率下鸡粪堆肥过程中抗生素的残留率Fig.2 The residual rate of antibiotics during chicken manure composting under 68.11% and 53.27% moisture

表4 不同初始含水率下鸡粪堆肥抗生素降解半衰期Table 4 Half-life of antibiotic degradation in different initial moisture during chicken manure composting

图3 反映了不翻堆、2 次/d 和1 次/2d 的翻堆频率对牛粪中抗生素含量变化的影响.SAs在堆肥32d均被完全去除,翻堆与不翻堆无显著差异(P>0.05).但在32d堆肥过程中,不翻堆处理对SAs 的去除效果优于翻堆处理.堆肥2d 后,SAs 在3 种处理下的残留率分别为17.03%、61.56%和41.84%.在第8d 时,不翻堆处理下,牛粪中SAs 被完全去除,而翻堆处理组中仍有46.11%和32.46%的SAs 残留.这表明不翻堆更有利于牛粪中SAs 的去除.在32d 堆肥后,FQs、TCs 和总抗生素在翻堆处理中的去除效果显著优于不翻堆处理(P<0.05),而1 次/2d 和2 次/d 的翻堆频率不具有显著差异(P>0.05).如图3所示,32d堆肥后,翻堆处理中FQs、TCs和总抗生素被完全去除,而不翻堆处理中各抗生素的残留率分别为25.53%、27.99%和16.48%.

图3 堆肥过程翻堆频率对抗生素残留的影响Fig.3 Changes of the residual rate of SAs, FQs, TCs and total antibiotics with different turning frequency during cow manure composting

通过堆肥过程中抗生素消减过程拟合(表5),发现不同翻堆频率下FQs、TCs 和总抗生素含量变化符合一级降解动力学拟合模型,其R2>0.68.并且翻堆处理牛粪中FQs、TCs 和总抗生素的降解速率常数均高于不翻堆条件下各类抗生素的降解速率常数.这表明堆肥过程中翻堆有利于加快粪便中抗生素的消减.尽管2 次/d 和1 次/2d 的翻堆频率均可在32d完全去除粪便中FQs 和TCs,但1 次/2d 翻堆处理过程中抗生素的降解速率常数高于2 次/d 翻堆处理,且抗生素的半衰期更短(表5).这说明1 次/2d 的翻堆处理可加快堆肥过程中抗生素的消减.综上,较低的堆肥湿度和翻堆频率会降低堆肥过程中抗生素的进一步消散.

表5 不同翻堆频率下牛粪堆肥过程中抗生素降解半衰期Table 5 Half-life of antibiotic degradation in different turning frequency during cow manure composting

3 讨论

本研究3 种畜禽粪便中均检测出抗生素残留,其残留含量在μg/kg 量级,比前期文献报道的残留含量低[4,18-19].Hu 等[20]研究表明,采样地区、时间以及抗生素使用情况的不同会造成检出的抗生素残留量差异.自2014 年开始,我国政府已开始关注畜牧业中抗生素使用问题,并采取了一系列措施来减少和禁止部分抗生素在养殖业中的使用,如NOR 等.此外,堆肥原料的采样开始于秋、冬季节,这期间养殖动物传染病发病率较低,治疗疾病所需的抗生素用量较少.这些原因可能导致样品中抗生素残留量较低.大量研究表明,SAs、FQs 和TCs 是畜禽粪便中主要的抗生素[5,14,21].同样地,本研究供试牛粪、猪粪和鸡粪中均检测到了SAs、FQs 和TCs 残留,但其检出率和残留量存在明显的差异.其中,畜禽粪便中SAs 检出率较低,其在牛粪中的检出率仅有6.7%.鸡粪中SAs检出率较高,为 53.3%,且检出总含量最高,为72.43μg/kg.SAs 只含有苯胺基和酰胺基两个离子型官能团,易发生水解[19];并且SAs 在畜禽粪便中的吸附作用较弱,具有较高的移动性[22].本研究中,牛粪含水率较高,因此,SAs 更容易随着牛的尿液进入污水管网.此外,SAs 主要用于治疗畜禽细菌感染疾病,在治疗鸡群细菌性疾病的用量较大[23],同时,鸡粪对抗生素的吸附固持能力要大于猪粪和牛粪[22].这就导致更多的SAs 在鸡粪中残留.FQs 和TCs 在3 种粪便中的检出率高,分别为46.15%～61.54%和75%～100%.但其在粪便中残留总含量分别为 26.26～37.1μg/kg和24.48～34.81μg/kg,低于SAs在粪便中残留总含量(除牛粪).这表明,在畜禽养殖过程中存在使用多种类、低剂量FQs 和TCs 的情况.与SAs 相比,由于FQs 和TCs 自身结构使其在畜禽粪便上的吸附能力更强[22],这也是粪便中FQs 和TCs 检出率高的原因之一.

本研究中,32d 堆肥后,3 种粪便中抗生素检出率明显下降.SAs、FQs 和TCs 的检出率分别由40.6%、53.1%和53.1%下降到28.1%、31.2%和25%.这表明,好氧堆肥有利于粪便中抗生素的去除.由于不同类型的抗生素具有不同的化学结构,导致其在堆肥过程中消减机制因其种类不同而存在显著差异[21].其中,SAs 检出率最低,除鸡粪中ST2 消减速率较慢外,其余SAs 去除率均高达90%.如前所述,SAs 结构简单和高移动性使其在堆肥过程中更容易受到含水率、温度等堆肥过程的影响而发生快速消减.FQs 和TCs 在粪便堆肥过程中降解较慢,其降解半衰期是SAs 的2 倍.对于FQs,PEF 在3 种堆肥过程中去除率均高于75%,表明好氧堆肥有利于PEF 的去除.但对于大多数FQs 来说,其在不同粪便堆肥中的去除率差异较大.以牛粪堆肥为例,32d 堆肥后,除SAR 和OFL 外,其他6 种FQs 去除率均在70%以上.与NOR 相比,OFL 的活化能较高,热稳定性能好,分解率较低[24].另一方面,NOR分子量较小,结构相对简单,易被微生物降解[25].32d 堆肥后,TCs 仍可以在猪粪和牛粪中100%检出.与SAs 和FQs 相比,TCs 分子中含有较多的极性/离子型官能团,如OTC 含有6 个-OH、2 个-C=O、1个-CONH2和1个-N(CH3)2,导致其在畜禽粪便中的吸附能力较强,难以通过生物作用完全去除[22].尽管如此,TCs 在3 种粪便堆肥中的去除率仍可达到60%以上,这与刘志平等研究相似[26].这表明好氧堆肥有利于降低粪便中TCs 的残留,但不能完全将其去除.

堆肥过程中,抗生素含量的降低并非完全是由微生物降解和抗生素本身结构性质所致.畜禽粪便理化性质、处理工艺以及抗生素初始浓度也是影响堆肥过程中抗生素含量变化的重要因素[14,18,21].大量研究认为,堆肥温度是抗生素去除的重要因素.抗生素的去除主要发生在升温及高温阶段,其去除率随着堆体温度的升高而提高[14,27].本研究中,堆肥第3d 堆体温度已达到55℃[17],由图3 可知,堆肥第4d时,3 种粪便中抗生素残留量迅速下降.这表明堆肥温度的升高有利于抗生素的去除.与上述因素相比,含水率是影响粪便堆肥中抗生素去除率的最重要的因素.研究发现,低含水率(53.27%)条件下鸡粪堆肥中各类抗生素残留含量显著高于68.11%含水率条件(图2).Zhang 等[13]在商业堆肥过程中发现,堆体含水率的降低导致四环素的去除率较低.研究表明,初始含水率过低会导致堆肥初期缺水,抑制微生物代谢,并且由于孔隙率高导致堆体热损失过大,形成生物不稳定产物[28-29].然而,研究也表明,过高的含水率会降低堆肥孔隙度,抑制氧气传质,使堆体缺氧,导致分解速度减慢.同时,高初始含水率还会导致游离水以渗滤液的形式排出,造成肥料的养分损失,也会造成环境负担和二次污染[28-30].因此,合适的含水率有利于促进堆肥过程中抗生素的消减.本试验含水率设置范围较窄,因此,在未来的研究中应进一步研究含水率对堆肥过程中抗生素及其他有机污染消减的影响.

本研究在堆肥过程中对堆体进行翻堆与不翻堆处理发现,相比于不翻堆,堆肥32d 时1 次/2d 翻堆处理组中FQs、TCs 和总抗生素残留率分别由25.52%、27.99%和16.48%降低至0、0 和0.这表明,堆肥过程中通过翻堆可以提高抗生素的去除率.同样地,韩进等[17]研究畜禽粪便堆肥过程中雌激素降解时,发现翻堆也可显著提高雌激素的降解效率.而Wallace 等[31]对牛粪厌氧堆肥中TCs 去除效果的研究发现,厌氧堆肥条件下TCs 的去除率仅有29%.供氧不足会抑制微生物活性,阻碍生物过程[32].翻堆可以满足堆体中的好氧微生物对氧气的需求,有利于好氧微生物的繁殖和活动,从而促进对抗生素等有机物的分解[21].但是,过度的翻堆频率不利于维持堆体温度,且会加速堆肥过程中水分的蒸发和NH3的生成,造成氮素损失,减低堆肥产品肥效和抗生素去除效率[21,33].本试验研究发现,尽管2 次/d 和1 次/2d的翻堆频率均能完全去除粪便中抗生素,但1 次/2d的翻堆频率下抗生素的去除速率常数明显高于2 次/d 的翻堆频率.这表明1 次/2d 的翻堆频率更有利于抗生素的快速去除.

综上,好氧堆肥条件有利于促进畜禽粪便中抗生素及其他痕量污染物的去除.然而,在堆肥过程中,由于粪便性质及污染物性质、含量、工艺条件的差异,使得部分抗生素难以完全去除,仍有大量抗生素残留在粪肥中.Zhou 等[5]对市售有机肥中抗生素进行调查发现,有机肥中有大量四环素残留,残留量高达1920μg/kg.这些残留的抗生素等药物经粪肥还田在土壤中积累会对生态环境造成一定的负面影响.Shen 等[34]发现,抗生素长期暴露下会提高生菜-土壤系统中水平基因转移潜力,增加抗生素抗性基因的相对丰度.因此,在堆肥过程中需根据堆肥原料制定适合的堆肥条件(含水率、翻堆频率、延长堆肥时间等)以提高抗生素及痕量污染物的去除效果、提高粪便有机肥肥效,实现畜禽粪便的无害化、资源化利用.

4 结论

4.1 畜禽粪便中均存在SAs、FQs 和TCs.3 种粪便中抗生素总含量大小顺序依次为:鸡粪(123.09μg/kg)>猪粪(107.32μg/kg)>牛粪(67.76μg/kg).

4.2 开放式好氧堆肥可有效去除粪便中的抗生素残留,其中SAs、FQs、TCs 和总抗生素的去除率分别可达94.47%、62.81%、64.69%和78.09%.

4.3 堆肥过程中初始含水率控制在68.11%并采用1 次/2d 的翻堆频率可加快粪便中抗生素残留的消减.