固相自养-异养反硝化脱氮同步去除微污染物

曹 阳,刘彩虹*,陈子惟,刘乾亮,何 强(.重庆大学环境与生态学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆 400044；.哈尔滨理工大学化学与环境工程学院,黑龙江 哈尔滨 50040)

目前,排放的污水主要包括市政和工业污水,不同污水中污染物成分差异较大,种类复杂,且不同污染物及其转化产物之间还会产生协同、拮抗等复合毒性作用,威胁生态安全和人类健康.其中,以重金属铬和高氯酸盐为代表的有害物污染问题不容忽视[1-2],药物与个人护理品(PPCPs)也在水体环境中频繁检出,常见的如双酚A(BPA)和萘普生(NPX)在污水中检出浓度为ng/L～μg/L 级别[3].在城镇污水厂处理过程中,以上微污染物常与NO3--N 共存,需同步去除.污水厂进水由于碳氮比(C/N)较低,常依赖于外加碳源实现出水中氮排放达标.为克服传统液体碳源易过量、易燃、有毒的弊端,近年来固相反硝化应运而生,其中以人工可降解多聚物与天然纤维复合而成的复合碳源[4]最具优势,但其在运行过程中仍存在脱氮效率不足等问题.近年来,有研究[5]表明铁(Fe2+)自养反硝化可实现高效脱氮,若将其与异养反硝化结合,可进一步减轻体系中各反硝化还原酶之间对碳源电子的竞争,整体提高反硝化效能.此外,硫自养反硝化可通过异养反硝化产生的碱和硫自养反硝化产生的酸实现酸碱互补、降低异养反硝化过程中污泥的产量、降低自养反硝化过程中SO42-的产量等途径增强体系中反硝化速率,同时降解高价态微污染物和PPCPs[6].

目前,大部分研究对于异养反硝化耦合铁(FeO)自养反硝化的研究较少,对于将异养-自养复合反硝化运用于痕量污染物(Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX)与NO3--N 同步去除的研究亦较少.基于此,本文在聚己内酯复合花生壳(PCL/PS)固体碳源的基础上,考察其分别耦合单质硫(S)、氧化铁(FeO)和同时耦合二者所构建的复合碳源对反硝化体系脱氮效能的强化作用,以及同步去除微污染物(以Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 为例)的能力,揭示复合自养/异养反硝化体系的微生物群落结构、功能种群分布的关联性及微观作用机制,旨在为尾水深度脱氮及微污染物同步处理工艺的构建提供参考.

1 材料与方法

1.1 固体碳源的制备与表征

花生壳作为富含木质素和纤维素的天然材料,具有强吸附性,选作复合碳源的天然成分(采购于中国重庆本地),同时选用PCL(分子量～50000Da,中国一顺工业有限公司)作为聚合物基,添加剂均为分析级采购.复合碳源制备方法如下:花生壳经蒸馏水洗涤后,在35℃下脱水,研磨成粉末.采用高速混合机(50KG-25,安博维机械有限公司,中国)对共混后的固体碳源进行均质处理,通过直径为2mm 的双螺杆挤出机(20R,南京永杰化工机械有限公司),按3mm的规格进行最后切割.制备的4 种固体碳源的原料组成及质量配比如表1 所示,该比例由前期研究[7]并结合双螺杆挤出机中可添加的天然材料的最大百分比确定.将制备的固体碳源在40℃下干燥15h后加入反应器.固体碳源采用 SEM(Gemini 300,ZEISS,德国)对其表面形貌进行表征,并对固体碳源上的微生物形态进行测定.固体碳源官能团利用傅里叶变换红外辐射(FTIR)光谱仪(Thermo Scientific Nicolet 6700)进行分析,采用KBr 压片法,波长范围4000～400cm-1.

表1 固体碳源组成及质量配比Table 1 Solid carbon source composition and mass ratio

1.2 实验污泥

实验所用污泥(MLSS=14380mg/L)为重庆鸡冠石污水处理厂厌氧池污泥.实验用水为人工模拟二级出水,COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN、PO43--P 浓度分别为157.21～212.66,0～0.15,0～0.11,8.42～13.94,10.23～14.71,9.41～11.54mg/L, pH 值为7.5～8.0.其它相关化学试剂如BPA(C15H16O2,MW=228.29)、重铬酸钾、高氯酸钠、NPX、1,5-二苯基碳酰二肼、丙酮等均为分析纯级别.所有溶液和储备液均采用超纯水配制.

1.3 实验方法

实验共分4 组(A～D,分别以Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 为目标去除微污染物),考察每组在4 种固体碳源体系下(PP、PP-S、PP-F、PP-SF)对微污染物的去除情况,并设置3 组平行. 原水中NO3-N 浓度为5mg/L,Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX 浓度分别为0.5mg/L,20mg/L,20μg/L 和20μg/L.

以500mL 厌氧瓶为反应容器,实验开始前,在每个厌氧瓶分别加入80g固体碳源和400mL实验配水,曝氮气15min,以排出配水和厌氧瓶内原有的氧气,再接种40mL 污泥.所有厌氧瓶瓶口均用丁基橡胶塞加铝盖密封,在25℃、40r/min 的温水摇床中运行.根据相关研究[8-9],设置运行周期为14d.实验开始后每24h 采样1 次,测定NO3-、NO2-、微污染物(Cr( Ⅵ)、ClO4-、BPA、NPX)及TOC 的含量.

1.4 分析仪器与测试方法

每24h 对反应器的出水取样并测试污染物浓度,常规水质指标测试前先经0.45µm 微孔的滤膜过滤,按照《水和废水监测分析方法》[10]进行检测.Cr( )Ⅵ浓度测定前水样用0.22μm 微孔滤膜二次过滤,依据《二苯碳酰二肼分光光度显色法》(GB7467-1987)使用紫外-可见分光光度计(UV-2600,日本)进行检测.采用Dionex Aquion(AQ)离子色谱进行ClO4-的检测分析.BPA 和NPX 使用高效液相色谱仪(HPLC)进行检测,色谱柱为CNW Athena C18-WP,5μm, 100A,直径为4.6mm,长度为250mm;柱温40℃;流动相比例甲醇:超纯水=75:25(V/V),柱温30℃,流速0.1mL/min,进样量10μL,保留时间3min,检测波长254nm.

1.5 微生物样品分析

实验结束后,在各组烧瓶的下层固态混合物中采集生物膜样本,进行微生物分析.将生物膜置于0.1mol/L 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,以225r/min 的转速振荡40min,使附着的生物膜悬浮.然后,将样品在10000r/min 下离心10min 后收集沉淀,并使用E.Z.N.A.土壤DNA 试剂盒(Omega Biotek,Norcross,GA,United States)进行DNA 提取和纯化.以27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和 338R(5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3')为引物,对V1～V2区域进行扩增,随后对纯化后的PCR 产物进行16S rDNA 高通量测序.基于KEGG 数据库中的16S rDNA数据,利用PICRUSt2 预测与微生物代谢相关的功能酶/基因,采用R 软件进行Pearson 相关性分析、IBM SPSS Statistics 26.0 软件进行组内和组间方差分析(ANOVA)、CANOCO5 软件进行主成分分析(PCA).

2 结果与讨论

2.1 固体碳源的表征

如图1 所示,PP 表面呈现粗糙的层状结构,可能是由于花生壳中富含木质纤维素,由于微生物附着通常会随载体表面粗糙度的增加而增加,PP 的层状结构将利于微生物的黏附.随着放大倍数增加,PP-S表面一些单质S 分子聚集形成团聚体堆积在PP 的表面及孔隙中,耦合了FeO 的固体碳源表面较为平整、有细小孔洞分布.二者同时耦合时,固体碳源表面既有S 粒聚集又有细小孔洞分布.从EDS 结果可知,耦合后材料的元素主要有C、O、Fe、S.从表面形貌的结果来看,S 已成功耦合在PP-S、PP-SF上,FeO 已成功耦合在PP-F、PP-SF 上,表明成功制备PP-S、PP-F、PP-SF3 种新型改性固体碳源.

图1 固体碳源表面的SEM 和EDS 表征结果Fig.1 SEM and EDS characterization results of solid carbon source surface

2.2 固体碳源反硝化及同步去除微污染物效能分析

2.2.1 复合自养-异养反硝化体系同步去除Cr( Ⅵ)由图2 可知,前期PP-S 平均脱氮率最高,反硝化性能最好.第3～5d,PP 和PP-S 对NO3--N 的去除率稳定在90%～95%,NO3--N 浓度低至0.29mg/L.但随着碳源的消耗,NO3--N 浓度逐渐上升,推测可能是前期异养反硝化作用较强,碳源减少,抑制微生物的代谢,迫使微生物逐步进入内源呼吸阶段.而PP 的回升幅度大于PP-S,推测是单质硫作为电子供体可以在系统电子供体相对不足时(C/N 下降)通过硫自养反硝化作用参与脱氮,弥补反应器中因碳源消耗造成的电子供体不足,同时生成H+分担部分碱度,保证脱氮效率稳定.该结果表明,单质硫作为系统备用电子供体,在碳源不足时可作为异养反硝化的补充,维持稳定的脱氮效率.然而,PP-F 的NO3--N 浓度一直保持较高水平,平均脱氮率仅有17.2%,可能是Fe2+在细胞外被氧化,生成的铁垢滞留在细胞周围,阻碍养分的吸收和代谢产物的外流,导致细胞活性下降甚至死亡[11].对于Cr( Ⅵ),4 组实验反应器均具有较好去除能力,Cr( Ⅵ)平均去除率分别为85%(PP)、82%(PPS)、75%(PP-F)、75%(PP-SF).其中,PP、PP-S、PP-SF中的最高去除率均可达92%.在整个实验周期内,每个反应器效能的变化趋势相似,表明各反应器的性能稳定且可重复.随实验进行,PP、PP-S、PP-SF 去除率略有上升最后稳定在85%左右,同时,NO3--N 去除率略有下降,推测后期NO3--N 与Cr( Ⅵ)对电子存在竞争关系,且Cr( Ⅵ)对电子供体具有更强的利用能力.

图2 投加微污染物为Cr( Ⅵ)时复合自养-异养反硝化体系对NO3--N 和Cr( Ⅵ)的去除Fig.2 The removal of NO3--N and Cr( Ⅵ) by the composite autotrophic-heterotrophic de nitrification system when the micropollutant was Cr(VI)

由此可见,PP 的反硝化脱氮同步去除Cr( Ⅵ)的能力最优,PP-S 其次,耦合自养反硝化后并未对体系内微污染物Cr( Ⅵ)的去除起到促进作用.但值得指出的是,PP-S 的脱氮速率较高,这主要是由于硫自养反硝化对反应进行了电子的补给.

2.2.2 复合自养-异养反硝化体系同步去除ClO4-由图3 可知,在ClO4-同时存在的情况下,4 种固体碳源对NO3--N 均可在5d 内实现90%的去除率.PP-S、PP-F 和PP-SF 于第3d 最先实现对NO3--N 的最大去除,NO3--N 浓度到达最低点,分别为0.67,1.22,0.51mg/L,而PP 则于第5d 降解NO3--N 最低至0.52mg/L,其中以PP-SF 的脱氮速率最快.体系对ClO4-的去除发生在NO3--N 被基本去除之后,前期NO3--N 浓度较高时ClO4-几乎无变化,当NO3--N 浓度低于1～2mg/L 时,ClO4-才开始呈现较明显的降解,这与Giblin 等[12]的研究结论一致.ClO4-浓度从第3d开始逐渐减少,且在第4～5dNO3--N 浓度降至最低时ClO4-的降解速率最快,并在第13～14dClO4-浓度降至最低(0.12mg/L),此时反应器对ClO4-去除率达到99.4%.这些现象说明与ClO4-相比,NO3--N 更易作为电子受体而被还原去除,同时NO3--N 几近完全降解时,可促进ClO4-的降解,这与谢宇轩[13]的结论一致.通过对比PP 的表现,耦合铁自养反硝化后反应器对高氯酸盐的去除性能明显有了极大提升,PP-F、PP-SF 的去除率分别高达99.4%、96.2%.与此同时,投加了FeO 的反应器中溶液变黄,且检测到有大量的Fe3+产生,说明FeO 为反应提供了电子,通过化学还原作用主导了高氯酸盐的降解.根据已有研究结果可知,铁自养反硝化过程中,Fe(II)的氧化由化学作用主导[20],Fe(II)作为电子供体协助去除ClO4-可能的化学反应式为:7Fe2++ClO4-+4H2O→7Fe3++Cl-+8OH-.由于S 在微生物作用下发生歧化反应:4S+4H2O→H2SO4+3H2S,产生大量H+,pH 值降低较快,抑制微生物对高氯酸根的降解[14],因此PP-SF 的去除率略低于PP-F.在后文微生物群落分析中,梭菌属数目的增加也证实此种情况,除FeO 的化学作用外,生物作用也不容忽视.

图3 投加微污染物为ClO4-时复合自养-异养反硝化体系对NO3--N 和的ClO4-去除Fig.3 The removal of NO3--N and ClO4- by the composite autotrophic-heterotrophic denitrification system when the micropollutant was ClO4-

总体评估,PP-SF 反硝化脱氮同步去除ClO4-的能力最优,其脱氮表现优于含铬体系,这可能是在高氯酸盐的存在下,NO3--N 更易被还原去除.耦合了铁自养反硝化后对体系内微污染物ClO4-的去除有了极大促进,但PP、PP-S 去除ClO4-的表现不佳,表明该体系中Fe(II)可能在促进ClO4-去除中起到了重要的作用.

2.2.3 复合自养-异养反硝化体系同步去除BPA从图4 可知,PP 的反硝化性能最好,对NO3--N 去除率高达100%,在PP 中添加S 或FeO 后,对NO3--N在前期有一定去除,后期产生抑制作用,尤其是添加了FeO 后,这可能是铁对微生物的抑制作用导致.此外,4 种碳源对BPA 表现出良好的去除能力,平均去除率皆为99%以上.结合BPA 和NO3--N 的去除趋势分析,可能源于PPCPs 的非生物转化,即在生物脱氮体系中,PPCPs 会与NH2OH、NO2-、NO3-等氮活性物质直接发生化学反应.Yu 等[15]研究发现向体系内加入的NH2OH(5μmol/L)能与体系内磺草灵直接反应,使其氮杂环上的-NH2发生羟基化反应,或氧化为NO2,并将邻位的-H 取代为-OH.此外,郑杰蓉等[23]发现相同时间内,投加乙酸钠后反硝化菌群对磺胺嘧啶(SDZ)的降解率提高40%左右,表明SDZ作为碳源与乙酸钠共同被反硝化菌群利用.由此推断,本实验体系内可能也存在异养菌将PPCPs 作为碳源利用的情况.

图4 投加微污染物为BPA 时复合自养-异养反硝化体系对NO3--N 和BPA 的去除Fig.4 The removal of NO3--N and BPA by the composite autotrophic-heterotrophic denitrification system when the micropollutant was BPA

通过总体评估,PP 的反硝化脱氮同步去除微污染物BPA的能力最优.各组固体碳源的脱氮同步去除BPA 表现中主要在反硝化脱氮方面有所差距.耦合自养反硝化后对体系效能无显著提升,但值得指出的是耦合硫自养后体系效能发挥更为稳定.

2.2.4 复合自养-异养反硝化体系同步去除NPX 由图5 可知,实验运行3～4d 时,各组均实现了对NO3--N 的最高去除,去除率分别为80.2%、87.4%、65.6%、95.4%,PP-SF 对NO3--N 的去除效果最好.各组均在9～10d 时实现了对NPX 的最高去除,去除率分别为100%、99.96%、97.35%、99.95%,这与 Marchlewicz 等[17]的研究结果相似.Marchlewicz 等从波兰某化工厂的土壤中分离出了可降解萘普生的菌株,当外加碳源对NPX 进行共代谢降解的过程中,萘普生的降解率显著提高,可达90%以上.但NPX 可能对自养微生物生长代谢产生一定干扰,因此耦合了自养反硝化后并未对异养反硝化去除微污染物产生促进作用.

通过综合评估,PP-SF 反硝化脱氮同步去除NPX 的能力最优,PP-S 次之.与BPA 体系类似,各组碳源主要在反硝化脱氮方面有所差距,耦合自养反硝化后体系效能有所提升并更为稳定.

2.2.5 固体碳源的优选与分析 通过对比4 种污染物体系中4 种固体碳源的反硝化脱氮与同步去除微污染物结果:(1)固体碳源不同,其所擅长降解的微污染物种类不同.经综合考评,本实验得到的脱氮与同步去除微污染物性能较好的固体碳源为PP 和PP-SF,其中PP 的脱氮及同步去除Cr(Ⅵ)和BPA 的能力较好,而PP-SF 则在去除ClO4-和NPX 时表现最好.

(2)在ClO4-的存在下,NO3--N 更易被还原去除,且体系中去除ClO4-的主要贡献者为铁自养反硝化反应.在Cr(Ⅵ)、BPA、NPX 存在时,各组固体碳源反硝化脱氮及同步去除微污染物的综合性能主要取决于反硝化脱氮方面的差距,而耦合了FeO 的固体碳源表现不太理想.这可能是由于Fe2+在反应过程中具有较强的还原性,极易失电子而被氧化,降低生物的利用率,从而出现钝化现象而降低脱氮效率[18],且Fe2+在酸性条件下较稳定,但大多数铁自养反硝化菌的生物活性会受到抑制.

(3)耦合了S 的固体碳源在脱氮和去除微污染物的表现中都取得了较稳定的成绩,其优势在于:产生适当酸度,平衡体系pH 值,与有机碳源一同为微生物提供了稳定的生长环境;硫自养过程中,S 元素由0 价变为+6 价,大大提高了对单位底物的供电子能力;在碳源消耗而减少时,硫自养反硝化承担部分NO3--N 负荷,弥补了系统反硝化效率不足的问题,同时也保证出水有机物含量较低.虽然耦合硫自养技术后呈现了明显的优势,但自养菌较异养菌相比生长繁殖速度慢,容易在底物(本实验为NO3--N、高价污染物)竞争中处于劣势,导致耦合体系稳定性不佳.因此,应深入研究如何控制实验条件使自养菌、异养菌之间更好地协作,促进脱氮和微污染物去除的效能提升.

2.3 微生物群落结构分析

在实验结束时,提取各组底部生物膜进行高通量测序,采用ACE、Chao1、Shannon 和Simpson4个指标,分析各反应器和接种污泥中的微生物群落多样性,同时对物种不同分类水平上的群落结构进行分析.通过表征微生物多样性及物种组成,考察各系统反硝化及同步去除微污染物的规律、机理及差异性.

2.3.1 Cr( Ⅵ)复合自养-异养反硝化体系 ACE 和Chao1 指数表示菌群丰富度且与菌群丰富度呈正相关,Shannon 和Simpson 指数表示菌群物种多样性程度,Shannon 指数与菌群多样性呈正相关,Simpson 指数与菌群多样性呈负相关.如表2 所示,与对照组相比,添加了S 或FeO 的体系中拥有更高的微生物丰富度和多样性,其中以PP-F最为显著,这可能是铁对反硝化有一定抑制作用,使活性污泥整体系统没有向以反硝化微生物为优势的方向发展,从而未能形成以优势种群领导的群落结构.

表2 Cr(Ⅵ )复合自养-异养反硝化体系中的生物多样性指数Table 2 Biodiversity index in Cr(VI) complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由图6(a)可知,4 组固体碳源的优势门均为Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门);添加了FeO的PP-F、PP-SF具有独特的优势门Bacteroidetes(拟杆菌门),添加了S 的PP-S、PP-SF 具有独特的优势门Patescibacteria(髌骨菌门).其中Proteobacteria 是固相反硝化系统(如PCL、PBS 等)中的优势种群,多数异养和自养反硝化菌均归属于Proteobacteria,具有强化脱氮作用[19],Firmicutes 和Bacteroidetes 则通常与有机物的水解、发酵及产酸有关,通常作为异养菌和脱氮功能菌参与到污水处理中[20].Patescibacteria 有同步硝化和反硝化功能,是厌氧氨氧化耦合反硝化启动的主要菌门之一[21-22].对比各组固体碳源对反硝化和微污染物去除的表现来看,PP 因具总量最多的反硝化主要菌门Proteobacteria和Firmicutes(二者相对丰度分别为36.2%、63.2%,共99.4%),在反硝化脱氮中表现最好,而耦合了S/FeO 自养反硝化后虽拥有丰富的微生物多样性但却并未对异养反硝化实现强化作用,可能与自养反硝化菌与异养反硝化菌存在一定的竞争关系有关.

图6 Cr(Ⅵ)(a)、ClO4-(b)、BPA(c)、NPX(d)复合自养-异养反硝化体系微生物在门(左)、属(右)水平上的种类及分布Fig.6 Species and distribution of microorganisms in Cr(Ⅵ)(a),ClO4-(b),BPA(c),NPX(d) complex autotrophic-heterotrophic denitrification system at phylum(left) and genus(right) levels

由图6(a)可知,在4 组固体碳源体系内均发现大量异养反硝化菌,如Clostridium_sensu_strito(梭菌属)、Lactococcus(乳球菌属)、Novosphingobium(新鞘氨醇杆菌属);添加了 FeO 的体系内还含有Prevotella_9(普雷沃氏菌属),属于拟杆菌门,可产生木质纤维素降解酶[23],促进纤维素降解.对照组PP中排名前三的优势属分别为 Clostridium_sensu_strito_1、Acetobacter(醋菌属)、Lactococcus,均属于厚壁菌门,相对丰度分别为34.6%、26.2%、21.9%,共计82.7%,远高于其他3 组,反硝化性能领先.其中,Lactococcus 代谢产生大量酸质,能迅速降低反应体系内的pH 值以防亚硝酸盐积累,同时促进Cr( Ⅵ)的去除,且能抑制其他有害微生物的繁殖[24].据研究[25],Lactococcus 还对难降解有机物具有降解能力.PP 中还发现了少量Nitrospira(硝化螺旋菌属),可参与亚硝酸盐氧化过程[26]产生硝酸盐,并利用硝酸盐为电子受体进行反应[27].

2.3.2 ClO4-复合自养-异养反硝化体系 如表3 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指数均显著大于PP,simpson 指数均小于PP,说明这三者具有更高的菌群丰富度和物种多样性,其中最高者为PP-SF,可能是硫自养反硝化、铁自养反硝化与异养反硝化耦合后反硝化细菌不断增长和富集的缘故.

表3 ClO4-复合自养-异养反硝化体系中的生物多样性指数Table 3 Biodiversity index in ClO4- complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由图 6(b)可知,4 组固体碳源的优势门为Proteobacteria(变形菌门)、Firmicutes(厚壁菌门),这与前文中Cr( Ⅵ)复合自养-异养反硝化体系群落结果相似.不同的是,添加了S/FeO 的PP-S、PP-F、PP-SF 中的优势门Bacteroidetes(拟杆菌门)远高于PP,而PP 中的优势门Patescibacteria(髌骨菌门)则多于前三者.有研究表明[28],这些菌群对生物膜反应器中污染物的去除起主要作用,Proteobacteria 和Firmicutes 可在厌氧环境下通过分解有机物来获取营养物质,与脱氮作用有关,且大多数高氯酸盐还原菌都属于变形菌Proteobacteria[29];Bacteroidetes 包括3 大类细菌:Bacteroides 、 Flavobacillus 和Sphingomycetes,可降解花生壳中丰富的纤维素[30].总体而言,4 组碳源中反硝化菌门Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes的总相对丰度为86%～93%,因此反硝化脱氮差异不大.

由图 6(b) 可知,Clostridium_sensu_strito 和Lactococcus是4组固体碳源体系已知的前两位优势属,均为具有反硝化脱氮、有机物降解功能的微生物.其中Clostridium(梭菌属)中包含一些可降解ClO4-的细菌、硫酸盐还原菌以及铁还原菌[31],在中性、中温条件下对ClO4-的去除率达90%以上[29],可在NO3--N浓度较低时将SO42-和Fe3+作为电子受体[32].在 PP 中发现了相对丰度为 5.4%的益生菌Acetobacter(醋菌属),而其他3 组中则含有相对丰度最高的自养反硝化菌Prevotella(普雷沃氏菌属),包括Prevotella_1、Prevotella_7、Prevotella_9.在PP-F中发现了3.56%的Parabacteroides(副杆状菌属),是一种典型厌氧菌,可通过糖酵解作用产生反硝化电子供体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)[33].此外,各组碳源体系均存在少量Denitratisoma(脱氮单胞菌属),为典型异养厌氧反硝化菌,与厌氧氨氧化菌之间存在一定协同效应[34].

2.3.3 BPA 复合自养-异养反硝化体系 如表4 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指数均大于PP,simpson 指数均小于PP,说明这三者比对照组具有更高的菌群丰富度和物种多样性,其中以PP-F、PP-SF 最为显著,推测FeO 可能为影响群落微生物多样性的最大因素.

表4 BPA 复合自养-异养反硝化体系中的生物多样性指数Table 4 Biodiversity index in BPA complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由图6(c)可知,4 组固体碳源的优势门均为Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门),其中PP-S、PP-F、PP-SF 中的优势门Bacteroidetes(拟杆菌门)多于PP,这与前文中ClO4-复合自养-异养反硝化体系的群落结果相似.不同的是,PP-S 中的优势门Patescibacteria(髌骨菌门)多于另外三者.总体上看,4 组固体碳源中脱氮功能菌的总相对丰度均高达95%以上,但各自脱氮能力有所差异.此外,生物脱氮中混合菌群的协同作用能实现PPCPs 较高去除,一方面,异养菌能直接对PPCPs 实现共代谢降解[35];另一方面,自养菌可将PPCPs 降解成简单产物,进一步被异养菌作为碳源利用,实现完全降解.同时,在复合反硝化体系中还发现了与硫自养反硝化有关的Epsilonbacteraeota(ε-变形菌门),可深度降解废水中难降解有机物[36].

由图6(c)可知,各固体碳源体系内优势菌属主要有Lactococcus、Novosphingobium、Clostridium_sensu_strito、Prevotella、Enterobacte(肠杆菌属)等,大多数为具有异养反硝化脱氮、污染物降解功能的微生物.其中,肠杆菌属在降解有机污染物过程中能释放生物表面活性剂,提高对污染物的生物利用率[37].同时,在PP-SF 中出现了2.62%的Pseudomonas(假单胞菌),兼具异养和自养反硝化及聚磷作用,并具有电化学活性[38].史江红等[39]分离出的一株香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)能实现对E1、E2 和EE2(均为甾体类雌激素,一种环境内分泌干扰物)的近100%降解,由此推测该菌属也可能对BPA 的降解有相当贡献.在PP 体系中,发现了相对丰度为3.82%的Acinetobacter(不动杆菌属)和2.41%的Kluyvera(克吕沃尔氏属),Acinetobacter 能降解芳香族化合物,Kluyvera 是变形杆菌在属水平上的异养反硝化优势菌种.研究表明,BPA 会抑制活性污泥脱氢酶活性,降低微生物的活菌比例[40],结合前文中各组碳源的反硝化脱氮同步BPA 降解的效能和菌属丰度差异,推测BPA 的存在降低了Lactococcus、Novosphingobium、Acinetobacter、Kluyvera 等菌属丰度,影响系统的脱氮性能.

2.3.4 NPX 复合自养-异养反硝化体系 如表5 所示,PP-S、PP-F、PP-SF 的ACE、Chao1 和Shannon指数均大于PP,simpson 指数均小于PP,说明这三者具有更高的菌群丰富度和物种多样性,其中PP-F 最高,表明FeO 是影响群落微生物多样性的最大因素,同时对比PP-S、PP-SF 的多样性指数,推测铁自养微生物和硫自养微生物在该体系下可能存在一定竞争关系.

表5 NPX 复合自养-异养反硝化体系中的生物多样性指数Table 5 Biodiversity index in NPX complex autotrophicheterotrophic denitrification system

由图6(d)可知,4 组固体碳源的优势门均为Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门),其中PP-S、PP-F、PP-SF 的优势门Bacteroidetes(拟杆菌门)多于PP,而PP-S 的优势门Patescibacteria(髌骨菌门)则多于另外三者,这与前文中BPA 复合自养-异养反硝化体系的群落结果一致.此外,在添加了S/FeO 的固体碳源体系中也发现了一定数量的Epsilonbacteraeota 和Nitrospirae(硝化螺旋菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门),均与反硝化作用有关,且PP-F中存在Actinobacteria(放线菌门,能够参与铁循环)和Deferribacteres(脱铁杆菌门,一种能厌氧降解芳烃的铁还原菌)[41].结合前文脱氮及同步去除微污染物的研究结果来看,PP-SF 因拥有最高丰度的脱氮功能菌而表现突出,其中 Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria 的相对丰度分别为43.74%、39.34%、14.03%,总丰度为97.11%.

由图6(d)可知,各固体碳源体系内的优势菌属为Clostridium_sensu_strito,其具有较强的有机物降解和无机物还原能力,易在厌氧环境中富集.通过对比,Lactococcus 和Lactobacillus 在PP 和PP-S 体系中的相对丰度明显高于PP-F 和PP-SF,而PP-F 和PP-SF 体系中的Prevotella_9 则远多于PP 和PP-S.另外,在 PP-F 中存在相对丰度为 5.02%的Parabacteroides(副杆状菌属),可进行糖酵解作用产酸,这与前文ClO4-体系中的结论一致.此外,PP-S 中发现有 8.50%的 Prevotella_7.结合前文研究发现,NPX 的添加虽然降低了PP-SF 体系中的微生物多样性,但增加了优势种群Clostridium_sensu_strito和Prevotella的相对丰度,且NPX本身或其降解产物可能对微生物有毒害作用,因此PP-SF 更有助于微生物在NPX 的环境中适应并繁殖.

2.3.5 各体系内微生物群落结构对比 微生物群落结构分析表明S 和FeO 的加入增加了固相反硝化体系中微生物的多样性和丰富度,使微生物群落结构趋于复杂,增加了Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria 等与木质纤维素降解和自养反硝化相关菌属,以及Pseudomonas 等好氧菌属的相对丰度,一定程度上提高了反硝化体系中有机质的降解和物质转化,但当体系中微生物多样性过高且各占有一定丰度时,反而不利于优势菌的形成,进而对体系反硝化性能造成负面影响. Clostridium_sensu_strito、Lactococcus 和Prevotella 是4 个固体碳源体系的主要优势菌属,影响体系脱氮作用,其总体相对丰度为PP>PP-SF>PP-S>PP-F,与实际反硝化脱氮和微污染物的去除表现大致一致,但由于其并非影响生物脱氮的唯一菌种,如 Novosphingobium、Enterobacte、Nitrospira、Kluyvera、Denitratisoma等也会对体系性能造成影响,因此PP 和PP-SF 在去除各微污染物时偶有起伏.同时,体系中微污染物的存在也会对微生物的种群丰富度和多样性产生影响,且在运行过程中,当条件受限时,由于一些菌种同时存在脱氮或者降解同种有机污染物,体系中反硝化脱氮和微污染物去除可能存在一定竞争关系,加之其去除机理复杂,包括自养菌转化、物理化学转化、异养微生物转化以及各菌群的协同作用等,还与进水组成、处理工艺工况、微生物活性和污染物质自身理化特性密切相关,其中哪种机理占主导作用还需进一步深入研究.

3 结论

3.1 固体碳源对微污染物降解的选择性不同.异养反硝化对于添加了Cr( Ⅵ)、BPA 的污水具有更好的反硝化脱氮和同步去除微污染物性能,如PP 对NO3--N、Cr( Ⅵ)的去除率分别为 94%、92%,对NO3--N、BPA 的去除率均可达99%以上;复合自养-异养生物反应体系可高效脱氮同步去除ClO4-、NPX,其中PP-SF 中的去除率最高,性能最稳定,其对NO3--N、ClO4-的去除率分别为 90%、96%,对NO3--N、NPX 的去除率分别为96%、99%,而PP-S和PP-F 的反硝化脱氮和同步去除微污染物性能较不稳定.

3.2 自养反硝化带来更丰富多样的微生物.硫自养反硝化和铁自养反硝化的耦合增加了固相反硝化体系中微生物的多样性和丰度,相关微生物主要来自Proteobacteria、Chloroflexi、Deferribacteres、Actinobacteria 等门类,同时与有机质降解相关的菌属及好氧菌属的数目有所增加,提高了对污染物的降解效能.对于 4 组固体碳源, Clostridium_sensu_strito、Lactococcus 和Prevotella 是决定反硝化脱氮的主要优势菌属,同时,体系中微污染物的存在和微生物群落间的相互作用也会对实验结果产生影响.