三种特应性疾病与斑秃发生风险的因果关系:两样本孟德尔随机化研究

徐媛媛 郭玲宏 吴姝玮 张 婷 张 璐 蒋 献

1四川大学华西医院皮肤性病科,四川成都,610041;2四川大学疾病分子网络前沿科学中心免疫炎症研究院皮肤病学研究室,四川成都,610041

斑秃(alopecia areata, AA)是一种普遍出现的炎症性非瘢痕性脱发疾病,其典型临床特征为头皮或/和身体其他部位呈现斑片状的毛发脱失,严重病例可能发展至全头皮甚至全身毛发的完全脱落[1]。作为一种自身免疫性疾病,斑秃的发病机制尚未明确,可能与毛囊的“免疫特权”被破坏,免疫系统错误地识别并攻击自体毛囊,从而引发一系列炎症反应和毛囊损伤有关[2,3]。斑秃的发生能够对患者的健康相关生活质量造成重大的负面影响,尤其是对患者的心理健康产生显著的损害,使患者面临更高的抑郁、焦虑、社交恐惧及人格障碍风险[4,5]。 目前,斑秃的治疗仍然面临显著挑战,至今尚未有被公认能够完全治愈该病症的疗法。常见的治疗策略主要基于对免疫反应的抑制或刺激,包括局部或系统性的皮质类固醇激素、接触免疫治疗、免疫调节剂、米诺地尔以及光疗等手段,其主要目的在于控制疾病的发展,刺激和促进毛发再生,但疗效通常有限[6-8]。

特应性疾病(atopic conditions),如哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎等,是一组由遗传因素和环境过敏原共同作用引发的免疫学相关疾病[9]。患有特应性疾病的个体通常具有特应性遗传易感性,当暴露于环境中的过敏原时,出现异常的免疫反应[10]。相对普通人群而言,特应性疾病患者更容易发展为斑秃;该现象在多项流行病学研究中得到证实,提示着特应性疾病与斑秃发病风险增加之间可能存在关联性[1,11,12]。然而,由于观察性流行病学本身性质所具有的限制,它们的结论容易受到环境因素或者统计过程中偏移的影响,且并不能揭示特应性疾病与斑秃发生风险之间是否存在因果关系。因此,特应性疾病是否是斑秃发生的危险因素仍然存在争议。

孟德尔随机化是一种利用基因变异作为工具变量,以推断暴露和结局之间的因果关系的研究[13]。 孟德尔随机化利用遗传变异的随机分布,规避了传统的观察性研究中来自混杂因素和反向因果关系的影响,使得其探究的关联结果更加准确可靠[14]。 目前,还没有研究应用孟德尔随机化来探究特应性疾病与斑秃发生风险之间的因果关系。因此,本研究旨在通过一项双样本孟德尔随机化研究,评估三种特应性疾病(哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎)与斑秃发生之间的潜在因果关系,以期为特应性疾病与斑秃两类疾病之间的关联性提供来自遗传学的证据。

1 对象和方法

1.1 研究设计 本研究使用全基因组关联研究 (genime-wide association study, GWAS)的汇总数据集进行两样本孟德尔随机化分析,探讨特应性疾病(包括哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎)对斑秃发生风险的潜在因果效应,并通过一系列后续敏感性分析检验该因果关联的可靠性。具体而言,分别将哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎被设定为暴露因素,将斑秃被设定为结局因素,而与哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎显著相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)则被应用为工具变量。

本研究所进行的两样本孟德尔随机化分析是基于三个假设,包括:(1)每次分析应用的工具变量分别与三种暴露因素(哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎)存在强烈的关联性;(2)工具变量与同暴露因素或者结局因素相关的任何其他混杂因素无关;(3)工具变量仅通过与暴露因素的关联影响结局因素。

1.2 数据来源与工具变量的选择 斑秃的汇总数据集来源于FinnGen Biobank (https://storage.googleapis.com/finngen-public-data-r9/summary_stats/finngen_R9_L12_ALOPECAREATA.gz),包含682例患者和361140名对照[15]。哮喘的相关数据来源是OpenGWAS数据库(ID: ebi-a-GCST90014325);该数据集包括56167例患者和352255名对照个体。特应性皮炎的汇总数据集来源于GWAS catalog数据库(ID: GCST900244787),包括60653例患者和804329名对照[16]。最后,过敏性鼻炎的遗传数据也来源于GWAS catalog数据库(GCST90086042),包括13936例患者和42701名对照[17]。暴露和结局的所有遗传数据未发现重叠现象,且均来自于欧洲血统的个体,以避免由于种族差异造成的偏移。由于所有的遗传数据均来源于公共数据库或者可以公开获取的文章,本研究并不涉及伦理批准或者患者知情同意。

为了确保SNP与各暴露因素强相关,将该关联性阈值设置为p-value< 5×10-8;为了避免连锁不平衡的干扰,将参数r2阈值设置为r2<0.001,遗传距离阈值设置为10000千碱基对(kilobase pairs, kb);为了避免弱工具变量可能造成的偏移,将F统计量的阈值设置为F>10。

1.3 统计学方法 本研究使用R语言(4.2.3版本)中的“TwoSampleMR”包进行所有的统计学分析。该两样本孟德尔随机化采用逆方差加权法(inverse-variance weighted, IVW)作为主要的分析方法,若存在明显异质性则采用随机效应模型,若无明显异质性则采用固定效应模型;也进一步采用MR-Egger回归、加权中位数、简单模型和加权模型4种方法进行补充分析,以验证逆方差加权法分析的可靠性。

除上述孟德尔随机化分析方法外,我们也进行了一系列额外分析,如使用Cochran Q检验以验证SNP间是否存在显著异质性、MR-Egger截距检验以验证所有结果中是否存在显著水平多效性、留一法(Leave-one-out analysis)检测暴露与结局之间的关联性是否主要受单个SNP的驱动和影响。本研究使用优势比(odds ratio,OR)及其95%置信区间(95%CI)以量化评估特应性疾病与斑秃之间的潜在因果关系。所有的统计检验均采用双尾检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 工具变量的筛选与确定 分别筛选与三种暴露因素显著相关的SNPs(P<5×10-8),并去除连锁不平衡的SNPs,最终筛选得到64个、61个以及3个SNPs,分别作为研究哮喘、特应性皮炎以及过敏性鼻炎与斑秃发病风险之间因果关系的工具变量。根据计算,三项关联研究中分别使用的工具变量F值均大于10,表明存在弱工具变量的风险较小。

2.2 特应性疾病对斑秃发病风险的影响 如表1及图1所示,依据IVW法的分析结果,基因预测的哮喘与斑秃发病风险增加相关(OR:1.45;95%CI:1.67～1.97),且哮喘与斑秃发病风险增加之间的关联性具有显著的统计学意义(P=0.017)。同样,IVW法分析表明基因预测的特应性皮炎与斑秃发病风险增加相关(OR:1.79;95%CI:1.28～2.51),且这种关联性具有显著的统计学意义(P=6.762×10-4)。哮喘与斑秃发病风险增加之间的关联性进一步被MR-Egger回归、加权中位数、简单模型和加权模型证实;而特应性皮炎与斑秃发病风险增加之间的关联性进一步被加权中位数和加权模型支持。此外,依据IVW法的分析结果,基因预测的过敏性鼻炎与斑秃发病风险之间虽然也呈现出正相关的趋势,但这种关联性并未达到显著的统计学意义(OR:1.88;95%CI:0.89～3.96;P=0.096)。

图1 三种特应性疾病与斑秃孟德尔随机化分析的散点图

表1 五种方法对三种特应性疾病与斑秃孟德尔随机化分析的结果

2.3 敏感性分析 此外,我们还分别对三种关联关系进行了一系列的敏感性分析,包括异质性检验、水平多效性检验、留一法分析、漏斗图等,以验证暴露因素和结局之间关联性的可靠性。SNP间的异质性通过Cochran Q检验进行验证,结果显示与哮喘密切相关的64个SNP间、与特应性皮炎密切相关的61个SNP间存在异质性(P=0.001;P=5.316×10-5),而和过敏性鼻炎(P=0.612)密切相关的SNP间均未发现显著异质性。依据异质性的存在与否,在使用IVW方法时选择相对应的模型进行分析。暴露因素与结局因素之间关联性是否存在水平多效性通过MR Egger截距检验进行验证,在哮喘与斑秃(P=0.158)、特应性皮炎与斑秃(P=0.888)、过敏性鼻炎与斑秃(P=0.503)三种关联性中均未发现显著的水平多效性存在。留一法的分析结果如图2所示。结果显示,三种特应性疾病与斑秃发病风险之间的关联性均未受到单一的SNP影响或者驱动,进一步验证了结果的可靠性和一致性。最后,漏斗图显示当以逐个SNP为工具变量时,哮喘和斑秃、特应性皮炎与斑秃之间的因果关联效应的散点基本对称分布于IVW法分析结果的两侧,表明不存在潜在的偏倚(图3)。

图2 三种特应性疾病与斑秃“留一法”分析的结果图

图3 孟德尔随机化分析漏斗图

3 讨论

本文基于孟德尔随机化的方法,从基因层面探究了三种特应性疾病(哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎)分别与斑秃发病风险之间的因果关系。本研究结果表明,基因预测的哮喘、特应性皮炎分别与斑秃发病风险之间存在显著正向的关联性,而过敏性鼻炎与斑秃发病风险之间则无显著关联性。本研究结果提示,在特应性疾病患者中,特别是针对哮喘患者以及特应性皮炎患者,需要警惕斑秃发病风险增高的可能性。

此前,已有很多观察性研究证明了特应性疾病与斑秃在流行病学上存在显著的关联性[11,12,18-20]。根据最近两项基于大型人群队列的研究结果显示[18,20],斑秃人群中特应性皮炎、哮喘和过敏性鼻炎等特应性疾病的患病率显著升高;且三种特应性疾病与斑秃之间均存在显著关联性。然而,由于这些回顾性研究设计的限制,它们并无法揭示特应性疾病与斑秃之间的时间相关性,因此无法验证特应性疾病与斑秃之间的因果关系[20]。 本项孟德尔随机化从基因层面进一步验证了过往回顾性研究结论的可靠性和一致性。虽然我们的研究仅得出哮喘或特应性皮炎与斑秃之间的显著关联性,过敏性鼻炎与斑秃之间的呈正向相关、但未达到显著统计学水平;但这可能是由于目前针对过敏性鼻炎能够公开获取的GWAS统计数据较为有限,相关GWAS研究所涉及的患者及对照组样本较小,因此所能作为工具变量使用的SNP数量较少,未能得到阳性结果。未来期待更多针对不同种族、更大样本数量的过敏性鼻炎患者的基因测序数据,以证实过敏性鼻炎与斑秃发病风险之间的因果关联。

尽管临床上将特应性疾病史视为斑秃的独立危险因素,然而特应性疾病增加斑秃发病风险的具体机制目前并不清楚[12,21]。过往研究和观点通常聚焦于斑秃病理过程中涉及的TH1/IFN-γ炎症反应,但近期研究表明TH2信号通路在斑秃发病中同样关键。TH2轴的关键细胞因子IL-4、IL-13与斑秃发病密切相关,一项针对斑秃患者和正常对照的GWAS研究证实IL-13是斑秃的易感基因位点[22];一项针对土耳其人群的基因分析研究显示,IL-4基因内含子多态性与斑秃的易感性相关[23]。此外,斑秃患者血浆以及头皮皮损部位均发现明显的TH2相关细胞因子的上升[24-27]。 部分病例报道以及2期临床试验证实了度普利尤单抗,一类抑制TH2信号通路的单克隆抗体,能够使得斑秃患者头发再生长;这进一步表明了TH2轴在斑秃发病中的潜在致病作用以及靶向TH2在治疗斑秃中的应用潜力[28-31]。 而TH2上调一直被认为是特应性疾病,特别是哮喘、特应性皮炎和过敏性鼻炎的重要特征,多项大型临床试验中应用靶向TH2的生物制剂治疗特应性疾病的有效性也进一步证实了TH2通路在这类疾病中的异常变化[32-34]。 此外,新型小分子靶向药物正处于皮肤病临床试验的最前沿;其中,口服酪氨酸蛋白激酶(JAK)抑制剂,如巴瑞替尼和托法替尼,均在斑秃和特应性皮炎的临床治疗中展现出良好的疗效和潜力[35]。目前已明确与斑秃发病密切相关的细胞因子如IFN-γ、IL-2等,以及与特应性皮炎密切相关的细胞因子如IL-4、IL-13、IFN-γ等,可通过刺激JAK/ STAT信号通路实现炎症反应的信号转导[36]。由此可见,特应性疾病与斑秃两类疾病之间可能共享相似的发病通路和遗传学背景。这可能是基因预测的特应性疾病增加斑秃发病风险的根本原因,而其中涉及的具体分子需要更多基础研究进行解释和支撑。

我们的研究存在限制。首先,在孟德尔随机化分析中完全排除多效性,即满足基本假设2是具有挑战性的,因为识别所有可影响暴露和结果的混杂因素是非常困难的。在孟德尔随机化分析之后,我们进行了MR- Egger截距检验以验证本项孟德尔随机化中不存在显著的水平多效性。其次,特应性疾病和斑秃的GWAS数据集均来自欧洲血统人群,以避免由于种族相关混杂因素造成的偏差,但是限制了我们推断不同人群结论的能力,因此需要对其他族群进行进一步的研究来验证我们的结论。最后,由于GWAS数据集中缺乏更多信息,本研究没有进行基于不同特征,如年龄、性别或疾病严重程度的分层分析。

综上所述,本项孟德尔随机化研究为基因预测的两种特应性疾病(哮喘、特应性皮炎)与斑秃发病风险之间的关联性提供了来自遗传学角度的相关证据。我们期待未来会有更完整与全面的相关GWAS汇总数据集,以进一步为过敏性鼻炎与斑秃发病风险之间的关联性提供证据支持。