三痹颗粒治疗类风湿性关节炎的临床观察及网络药理学研究

邹滔 谢湘雄 禹勇军 梁权兵

摘要：目的  觀察三痹颗粒治疗类风湿性关节炎（RA）的临床疗效，并采用网络药理学对其作用机制进行初探。方法  选取2021年1月-2022年12月娄底市中医医院收治的RA患者96例，随机分为研究组（48例）和对照组（48例），对照组给予常规药物治疗，研究组在此基础上给予三痹颗粒治疗，比较两组治疗2个月后临床疗效及血清指标[红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（ACPA）及白细胞介素-6（IL-6）]。另基于网络药理学方法，首先利用TCMSP数据库数据库筛选三痹颗粒的有效成分和作用靶点，将结果在Gene Cards数据库中检索抗RA相关靶点，求交集获得关键核心靶点；其次，借助STRING数据库进行蛋白互作分析，通过DAVID数据库进行基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；最后，利用Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白互作和“活性成分-靶点-通路”网络。结果  治疗组总有效率为96.50%，高于对照组的68.75%（P＜0.05）；治疗组治疗后2个月后ESR、CRP、RF、ACPA、IL-6水平优于对照组（P＜0.05）。网络药理学研究分析得到21个关键活性成分和27个潜在靶点，主要通过10条关键信号通路发挥抗RA作用。结论  三痹颗粒治疗RA具有多成分、多靶点、多通路的协同干预作用特点，能有效改善RA患者临床症状，临床效果确切。

关键词：三痹颗粒；类风湿性关节炎；网络药理学

中图分类号：R593.22                                文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.003

文章编号：1006-1959（2024）04-0014-07

Clinical Observation and Network Pharmacology Study on the Treatment of Rheumatoid Arthritis

with Sanbi Granule

ZOU Tao1，XIE Xiang-xiong1，YU Yong-jun1，LIANG Quan-bing2

（Department of Pharmacy1，Acupuncture Rehabilitation Center2，Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine，

Loudi 417000，Hunan，China）

Abstract：Objective  To observe the clinical efficacy of Sanbi Granules in the treatment of rheumatoid arthritis （RA）， and to explore its mechanism of action by network pharmacology.Methods  A total of 96 patients with RA treated in the Loudi Hospital of Traditional Chinese Medicine from January 2021 to December 2022 were selected and randomly divided into study group （48 patients） and control group （48 patients）. The control group was given conventional drug treatment， and the research group was given Sanbi granules on the basis of this treatment. The clinical efficacy and serum indexes [erythrocyte sedimentation rate （ESR）， C-reactive protein （CRP）， rheumatoid factor （RF）， anti-cyclic citrullinated peptide antibody （ACPA） and interleukin-6 （IL-6）] were compared between the two groups after 2 months of treatment. Based on the network pharmacological method， first， the effective components and targets of Sanbi granules were screened with TCMSP database， the key core targets were obtained by intersection of the results and the anti-RA related targets retrieved from Gene Cards databases. Secondly， STRING database was used for protein interaction analysis， protein interaction and active components-targets-pathway network was constructed by Cytoscape 3.6.1. Finally， gene ontology （GO） function and KEGG pathway enrichment analysis were performed by DAVID database， and the above results were verified by molecular docking technique.Results  The total effective rate of the treatment group was 96.50%， which was higher than 68.75% of the control group （P<0.05）. The levels of ESR， CRP， RF， ACPA and IL-6 in the treatment group were better than those in the control group 2 months after treatment （P<0.05）. Through network pharmacology analysis， 21 key active components and 27 potential targets were obtained， which mainly played an anti-RA role through 10 key signaling pathways.Conclusion  Sanbi granules have the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway synergistic intervention in the treatment of RA， which can significantly improve the clinical symptoms of RA patients and the clinical effect is remarkable.

Key words：Sanbi granule;Rheumatoid arthritis;Network pharmacology

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）一种最常见的自身免疫疾病，易反复发作，早期以关节疼痛、肿胀及功能受限为特征，后期发展导致各关节畸形及功能受限，对患者家庭及社会造成沉重负担[1，2]。当前临床上通常使用非甾体抗炎类药物来控制疾病，但是此类药物不良反应较大，且不能长期使用，导致治疗效果与患者依从性较差[3]。RA属中医“痹症”范畴，《黄帝内经》记载：“风寒湿三气杂至，合而为痹也”。中医药在RA的治疗中具有疗效确切、副作用小、价格便宜等特点，与化药治疗相比优势显著[4]。三痹颗粒为娄底市中医医院临床验方，主要由黄芪、人参、当归、川芎等16味中药组成，具有益气活血、除湿通络等功效，临床上常用于RA的治疗。但目前三痹颗粒在RA治疗中临床疗效和安全性循证证据不足，并且其治疗RA的潜在作用机制也有待明确。网络药理学可运用数据库和计算机软件，构建“中药-有效成分-靶点-通路”网络以揭示其复杂药理机制，与传统的单靶点作用模式相比，更适合研究中药复方的复杂应用[5，6]。因此，本研究搜集三痹颗粒在RA中的临床效果信息，并利用网络药理学方法初步阐明三痹颗粒在RA中的关键药效物质与潜在作用机制，为后续该方的进一步应用和推广提供科学依据。

1资料与方法

1.1临床对照试验

1.1.1一般资料  选取2021年1月-2022年12月就诊于娄底市中医医院的RA患者96例，按照随机数字表法分为研究组（48例）和对照组（48例）。研究组男11例，女37例，年龄26～71岁，平均年龄（42.32±5.46）岁；病程3个月～21年，平均病程（15.32±3.79）年。对照组男10例，女38例，年龄25～72岁，平均年龄（42.14±6.21）岁；病程3个月～22年，平均病程（15.09±4.22）年。两组性别、年龄和病程比较，差异无统计学意义（P>0.05），资料均衡可比。本研究已经得到医院伦理委员会的批准，并得到患者的知情同意，同时也签署了知情同意书。

1.1.2诊断标准  所有入选患者均符合2010年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）/欧洲抗风湿联盟（European League Against Rheumatism，EULAR）发布的RA西医分类标准。中医诊断标准与《中药新药临床研究指导原则》RA寒湿痹阻证的辨证标准一致，其主要证候：关节胀痛、遇冷痛剧、清晨僵直、屈伸不畅、局部喜温凉；次症：乏力、口不渴、寒冷和天气变化增加、四肢沉重等；舌脉：舌质淡、苔薄，脉弦细、浮或沉[7]。

1.1.3纳入及排除标准  纳入标准：符合上述诊断标准，患者1个月内未使用非甾体类抗炎药等抗风湿药物。排除标准：合并有其它风湿病的患者；疾病晚期，关节严重畸形或并发症严重；妊娠及哺乳期女性；有严重基础疾病的患者，如严重心肺功能不全、肝肾功能严重受损等；正在参与其它药物临床试验者；过敏体质者。

1.1.4治疗方法  对照组患者口服甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂有限公司，国药准字H31020644，规格：2.5 mg/片），10 mg/次， 1次/周。研究组在对照组服药基础上加用三痹颗粒（本院制剂室生产，组成：黄芪30 g、人参3 g、续断15 g、细辛3 g、杜仲15 g、防风10 g、肉桂5 g、茯苓15 g、白芍15 g、炙甘草10 g、生地15 g、川芎10 g、川牛膝15 g、紅花10 g、伸筋草15 g、当归15 g），温水冲服，2次/d。

1.1.5观察指标  治疗2个月后，比较两组临床疗效及血清指标。临床疗效：根据病情的严重程度，证候积分可以被分类为无、轻、中、重度。主要症状的评分分别是0、2、4、6分，而次要症状的评分则是0、1、2、3分。显效为明显改善了患者的中医临床症状和体征，同时证候积分减少不少于70%；有效为改善了患者的中医临床症状和体征，证候积分减少在30%～70%；无效为没有改善或者加重了患者的中医临床症状和体征，证候积分减少小于30%。血清指标：采用魏氏法检测红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）；采用胶乳增强免疫比浊法检测类风湿因子（rheumatoid factor，RF）和C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）；采用ELISA法检测抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，ACPA）和白细胞介素-6（IL-6）。

1.1.6统计学方法  采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，采用t检验分析计量资料，以（x±s）表示，采用？字2检验分析计数资料，以（n，%）表示，其中P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2网络药理学分析

1.2.1三痹颗粒化学成分和作用靶点筛选  通过TCMSP数据库对三痹颗粒处方中的化合物进行检索，在“Related Targets”页面导入化合物的编号，获得其靶标蛋白。在Uniport数据库（https：//www.uniprot.org/）中导入获取的化合物靶点资料，采用STRING（https：//string-db.org/）中Multiple proteins和 UniProt（http：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，进行标准化得到结果。从Gene Cards数据库（https：//www.genecards.org/）检索类风湿性关节炎的相关靶点并将其结果引入Excel中，与处方成分靶点共同引入Venny 2.1.0数据库（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）映射，记录两者的交集部分，并绘制韦恩图。

1.2.2蛋白质相互作用（PPI）网络的构建  将上述筛选所得到潜在靶点输入STRING数据库（https：//bioinformatics.com.cn/），置信度为0.09，获取交集靶点的PPI网络图，并利用Cytoscape 3.9.1软件中CytoNCA插件对网络图进行绘制。

1.2.3 靶点基因功能与靶点通路富集分析  将筛选出的三痹颗粒潜在靶点导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）数据库，设定物种条件为“Homo sapiens”，采取基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设定阈值P＜0.05，再用GraphPad Prism 8.0将结果可视化。

1.2.4“活性成分-靶点网络-通路”网络的构建  利用Cytoscape 3.9.1软件，构建处方“成分-靶点-通路”网络，分析化合物和靶点间的度（degree）值关系，其中节点代表化学成分、靶点和信号通路，边用来连接化学成分、靶点和信号通路。

2结果

2.1临床观察结果

2.1.1两组临床疗效比较  治疗2个月后，研究组临床总有效率高于对照组（P＜0.05），见表1。

2.1.2两组治疗前后血清指标比较  治疗2个月后，两组ESR、CRP、RF、ACPA、IL-6水平优于治疗前，且研究组优于对照组（P＜0.05），见表2。

2.2网络药理学研究结果

2.2.1三痹颗粒化学成分及其作用靶点的搜集  通过TCMSP获取三痹颗粒处方332个无重复靶点，通过Gene Cards查询获得抗RA作用靶点2787个无重复靶点。通过在线韦恩图可知，处方中化合物与抗RA作用的交集基因有191个，分别为IL6、TNF、CRP等，借助Venny 2.1.0将结果可视化，结果见图1。

2.2.2 PPI网络图的构建及核心靶点筛选  将上述韦恩图结果中的交集靶点输入到STRING数据库，获取靶点相互作用的网络关系数据，随后将其导入Cytoscape 3.9.1软件，建立PPI蛋白网络图（图2），网络含有157个节点和778条边（剔除5个游离靶点）。利用Cytoscape 3.9.1软件中CytoNCA插件对网络图进行分析，获取处方治疗湿疹的核心靶点，degree值排名前10的核心靶点分别是AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6。

2.2.3 GO功能和KEGG通路富集分析  通过GO功能富集分析，共获得GO条目387个，包括生物过程（biological process）条目315个，涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、DNA转录的正调控等；细胞组成（cellular component）条目20个，涉及核质、细胞质、细胞溶胶等；分子功能（molecular function）条目52个，涉及酶结合、蛋白结合、转录因子等，见图3。通过KEGG通路富集分析，共获得143条信号通路，涉及MAPK、Dectin-1、TNF、IL-17、Toll样受体信号通路等，排名前10个通路的气泡图见图4。

2.2.4处方“成分-靶点-通路”网络的构建  该网络由58个节点（包含21种活性成分、27个靶点、10个关键通路节点）和183条边，其中化学成分槲皮素、汉黄芩素、木犀草素等节点较大，提示这些成分可能是三痹颗粒的主要活性成分，另外MAPK14、AKT1、RELA等靶点节点较大，提示这些靶点可能是三痹颗粒发挥治疗作用的关键靶点，见图5。

3讨论

RA是以关节损伤为主的慢性自身免疫性疾病之一，其病因和发病机制尚不十分清楚，临床治疗主要是控制症状和延缓病情。中医学把RA归属痹症范畴，治以温经散寒、祛风除湿。三痹颗粒是娄底市中医院临床验方，本方以人参、黄芪补气为君药，当归、川芎、白芍、红花补血活血为臣药，佐以防风、细辛、茯苓等伸筋草之类以祛风除湿，肉桂、续断、牛膝以补肾散寒，使以炙甘草与诸药调和，諸药配伍共奏温经散寒、祛风除湿之功效。

临床上通常采用RF和ACPA对RA进行诊断分类，CRP和ESR水平是判断RA病情活动度和评价治疗效果的重要指标，促炎因子IL-6与RA的疾病活动、发展变化和治疗效果密切相关。本临床研究结果显示，研究组治疗2个月后总有效率高于对照组（P＜0.05）；研究组和对照组治疗2个月后RF、ACPA、ESR、CRP、IL-6水平均低于治疗前，且研究组优于对照组（P＜0.05），提示寒湿痹阻型RA患者通过服用三痹颗粒能够有效改善其临床症状，同时可降低ESR、CRP、RF、ACPA及IL-6水平，延缓病情进展。此外，本研究通过网络药理学方法筛选三痹颗粒中活性成分靶点，发现槲皮素、汉黄芩素、木犀草素连接的靶点较多，是治疗RA的潜在关键药效成分，且这三种成分均为黄酮类化合物，这可能与黄酮类化合物抗炎和抗氧化的作用机制有密切关系[8，9]。槲皮素广泛分布于植物的各个部位，且生物学活性多样化，如消除炎症及微生物、抗过敏和防止糖尿病并发症等[10，11]。研究表明[12]，槲皮素能降低RA实验模型炎症，表现出对肝脏的保护作用；同时，其能有效降低RA成纤维滑膜细胞炎症因子和基质金属蛋白酶表达，其作用机制可能与抑制NF-κB表达有关[13]。汉黄芩素常用于治疗一些过敏性和炎症性疾病[14]。研究发现[15]，汉黄芩素能抑制氧化应激和炎症因子的侵袭，对RA有预防作用。而木犀草素可通过抑制滑膜中炎性细胞因子和基质水解酶的表达发挥RA的治疗作用[16]。

另外，本研究中三痹颗粒治疗RA靶点PPI网络显示，AKT1、TP53、MAPK3、MAPK1、RELA、TNF、MAPK14、ESR1、FOS、IL6等27个靶点是三痹颗粒治疗RA的关键靶点。各种炎性细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳生成、及骨组织损伤是RA的主要病理特点[17]。有研究显示[18]，AKT在RA滑膜细胞中高表达，故认为AKT与RA成纤维样滑膜细胞过度增殖可能呈正相关。TP53在RA滑膜来源的间充质干细胞中表达下调[19]，TP53能显著减轻佐剂诱导的关节炎大鼠滑膜炎，降低IL-6水平[20]。IL-6在免疫应答、造血和中枢神经系统中都扮演着关键角色，RA患者血清和滑膜腔内IL-6的浓度与其疾病的活跃性紧密相连[21-23]。本研究通过GO富集分析及KEGG通路富集分析，初步得到三痹颗粒主要通过MAPK、C-type lectin receptor、TNF等途径来对RA进行治疗的。TNF是经典细胞因子通路之一，可调控RA患者的破骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞的功能，通过激发炎性细胞因子生成、滑膜增殖、血管翳生成，以及破坏骨和软骨，从而导致RA的产生，因此它是治疗RA的关键目标路径之一[24-27]。

綜上所述，三痹颗粒能够有效改善寒湿痹阻型RA患者的临床症状及体征，其治疗RA的关键药效物质为槲皮素、汉黄芩素、木犀草素，抗RA的作用机制与MAPK、C-type lectin receptor、TNF通路相关。

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收稿日期：2023-04-12；修回日期：2023-04-25

編辑/杜帆