瘢痕疙瘩患者瘢痕组织Klotho、MYH9表达变化与术后复发的相关性

杜全全，刘鹏超，韩福生，缪国东，马志红

1 承德医学院研究生院，河北承德 067000；2 承德市中心医院医疗美容科

瘢痕疙瘩是一种特殊类型的病理性瘢痕，主要病理表现为真皮组织成纤维细胞异常增殖、代谢过度活跃以及细胞外基质异常堆积等［1］。瘢痕疙瘩临床表现为瘙痒、疼痛，影响患者容貌，导致患者心理压力增大。瘢痕疙瘩的治疗方法有放射治疗、化学治疗、激素治疗、手术治疗等，单纯手术治疗后复发率较高，因此《中国瘢痕疙瘩临床治疗推荐指南》推荐以手术治疗为主的综合治疗［2］。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路激活导致瘢痕疙瘩成纤维细胞过度增殖，是形成瘢痕疙瘩的主要原因之一［3］。Klotho是一种长寿相关蛋白，能够拮抗Wnt信号通路，抑制肿瘤和纤维化疾病的进展［4-5］。肌球蛋白重链9（MYH9）是机械传导的重要信号分子，具有激活Wnt信号通路的作用，能够促进骨肉瘤、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤进展［6-8］。基于瘢痕疙瘩的类肿瘤特性［9］，本研究通过检测Klotho 和MYH9 在瘢痕组织中的表达情况，探讨其对瘢痕疙瘩术后复发的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年4 月—2022 年4 月在我院接受手术切除治疗的耳部瘢痕疙瘩患者71 例（观察组），其中男32 例、女39 例，年龄19～49（33.23 ± 3.82）岁。纳入标准：年龄18～60 岁；根据《中国整形外科学》的诊断标准确诊为瘢痕疙瘩；病灶处无感染；精神正常，无意识障碍；能够配合治疗并完成随访。排除标准：有瘢痕疙瘩手术、放射或激素治疗史；合并高血压、糖尿病等可能影响瘢痕愈合的疾病；合并免疫系统功能障碍；妊娠或哺乳期女性。选择同期在我院接受重睑术切除正常上睑皮肤者39例（对照组），其中男17例、女22例，年龄18～51（33.37 ± 3.93）岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经承德市中心医院医学伦理委员会审核批准（批号：CDCHLL2022-408），患者均知情同意并签署同意书。

1.2 组织Klotho、MYH9 检测方法 采用免疫组化染色法。取手术切除组织，制备石蜡切片，脱蜡后经自来水洗涤，加入枸橼酸缓冲液，微波加热修复抗原，室温冷却后加入H2O2灭活内源性过氧化物酶。山羊血清室温封闭30 min，分别加入Klotho、MYH9一抗（稀释比例分别为1∶400、1∶200）4 ℃孵育过夜。PBS 清洗，加入二抗，室温孵育30 min。DBA 染色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下拍照观察。由两位有经验的病理医生采用双盲法进行结果判断。Klotho 染色呈棕黄色细颗粒状，主要定位于细胞质、细胞膜及细胞间质；MYH9染色呈棕黄色细颗粒状，主要定位于细胞质。染色强度评分：无色为0分，淡黄色为为1分，黄色为2 分，棕黄色或黄褐色为3 分。阳性细胞百分率评分：阳性细胞＜5%为0 分，5%～＜25%为1 分，25%～＜50%为2 分，≥50%为3 分。将两项评分相乘计算免疫染色指数（SI），SI＜3分为阴性，SI≥3分为阳性。

1.3 观察组术后随访方法 以瘢痕疙瘩患者手术日期为起点，术后12 个月进行随访观察，记录复发情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料正态性检验采用K-S 检验（样本量＞50）或S-W检验（样本量＜50），呈正态分布的数据以±s表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以例（百分数）表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Kendall's tau-b 等级相关系数法，预后分析采用Kaplan-Meier 生存分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组组织Klotho、MYH9 表达比较 观察组瘢痕组织Klotho 阳性27 例（38.03%）、阴性44 例（61.97%），MYH9 阳性48 例（67.61%）、阴性23 例（32.39%）；对照组正常上睑皮肤组织Klotho 阳性25 例（64.11%）、阴性14 例（35.89%），MYH9 阳性16 例（41.03%）、阴性23 例（58.97%）。观察组Klotho阳性表达率低于对照组，MYH9 阳性率高于对照组（P均＜0.01）。

2.2 瘢痕组织Klotho 与MYH9 表达的相关性 瘢痕组织Klotho 表达水平与MYH9 表达水平呈负相关（r=-0.225，P=0.013）。

2.3 瘢痕组织Klotho、MYH9 不同表达水平患者的预后比较 71例瘢痕疙瘩患者中，术后12个月复发24 例、未复发47 例。Klotho 阳性患者复发3 例（12.50%）、复发时间（14.42 ± 0.33）个月，Klotho 阴性患者复发21 例（87.50%）、复发时间（10.53 ±0.51）个月，Klotho 阳性患者复发率较阴性患者降低，复发时间较阴性患者延长（P均＜0.01）。MYH9阳性患者复发23 例（95.83%）、复发时间（10.66 ±0.48）个月，MYH9阴性患者复发1例（4.17%）、复发时间（14.76 ± 0.23）个月，MYH9阳性患者复发率较阴性患者升高，复发时间较阴性患者缩短（P均＜0.01）。

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种成纤维细胞过度增殖和细胞外基质异常堆积引起的疾病，其确切发病机制尚不清楚，可能与Wnt/β-catenin 信号通路密切相关［3］。Wnt/β-catenin 信号通路是调节细胞增殖和分化的关键信号通路之一，在Wnt/β-catenin 信号通路中，信号传导的核心是β-catenin 蛋白［12］。当Wnt/β-catenin 信号通路关闭时，细胞质中形成β-catenin降解复合体，该复合体由轴蛋白、腺瘤性结肠息肉蛋白以及糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和酪蛋白激酶1 组成，该复合体能特异性识别β-catenin，并将其磷酸化和泛素化，最终将其降解［13］。当Wnt 信号作用于细胞表面特异性受体时，胞内蓬乱蛋白被激活，活化的蓬乱蛋白将轴蛋白、GSK-3β 等募集到细胞膜中，从而减少细胞质中的β-catenin 降解复合体，稳定细胞质中游离状态的β-catenin 蛋白，并经APC 转运进入细胞核内，激活下游基因转录，促进细胞增殖、存活、分化和迁移基因表达，导致瘢痕疙瘩发生［14］。

Klotho 最初被认为是一种长寿蛋白。动物实验发现，过表达Klotho 可延长小鼠寿命，而Klotho 缺陷小鼠则表现出早衰综合征。随后研究发现，Klotho不仅具有抗衰老作用，还有抗纤维化和抗肿瘤特性。Klotho 可以直接与Wnt 蛋白相互作用，阻断其与Wnt 受体的结合和激活，细胞质内β-catenin 降解复合体增多，使β-catenin 通路被抑制，从而改善肾脏、腹膜等器官的纤维化［15-17］。TANG 等［18］报道，在人肝细胞癌中，Klotho可直接与Wnt结合，抑制Wnt/β-catenin 信号通路；Klotho 作为肿瘤抑制因子抑制肝癌细胞生长并促进其凋亡，从而延长患者总体生存期。瘢痕疙瘩是一种纤维化疾病，同时具有类肿瘤特性，目前尚未发现Klotho 在瘢痕组织中表达情况的相关报道。本研究结果显示，瘢痕组织中的Klotho 表达水平低于正常组织；瘢痕组织Klotho 阳性患者的术后复发率低于阴性患者，复发时间晚于阴性患者。这表明Klotho表达水平降低与瘢痕疙瘩术后复发密切相关。

MYH9 是一种广泛表达的细胞质肌球蛋白，参与细胞黏附、迁移、分裂和形态维持。MYH9作为肿瘤促进因子，通过与GSK3β 相互作用，使细胞质β-catenin 降解复合体减少，细胞内游离的β-catenin增多，激活β-catenin 通路，促进肿瘤进展。LIN 等［19］报道，MYH9可诱导GSK3β的泛素化和降解，增强肝细胞癌的转移性、增殖性和索拉非尼耐药性；靶向抑制MYH9 能够提高肝细胞癌小鼠的存活率，并促进肝癌细胞在体内对索拉非尼的敏感性。LIU 等［20］研究发现，MYH9 与GSK3β 相互作用，通过激活PI3K/AKT/c-Jun 通路诱导的泛素表达，促进GSK3β 蛋白泛素化降解，抑制β-catenin 降解复合体的形成，从而激活β-catenin 表达及其在鼻咽癌细胞中的核易位。ZHANG等［21］报道，长链非编码RNA MRPL23-AS1通过上调MYH9 激活Wnt/β-catenin 通路，促进骨肉瘤发生发展。本研究结果显示，瘢痕组织中MYH9表达水平高于正常组织；瘢痕组织MYH9 阴性患者术后复发率低于阳性患者，复发时间晚于阳性患者。这表明MYH9表达水平升高与瘢痕疙瘩术后复发密切相关。

Klotho 和MYH9通过影响Wnt/β-catenin 信号通路影响肿瘤的进展，可作为多种肿瘤治疗的关键靶点以及预测肿瘤复发情况的重要指标。瘢痕疙瘩具有类肿瘤特性，Wnt/β-catenin 作为瘢痕疙瘩的主要发病机制之一，Klotho 和MYH9 很有可能通过作用于Wnt/β-catenin 通路影响瘢痕疙瘩。本研究相关性分析显示，瘢痕组织中Klotho 和MYH9 表达水平呈负相关，Klotho 在瘢痕组织中呈阴性表达，MYH9在瘢痕疙瘩中呈阳性表达，这与Klotho 和MYH9 在肿瘤中的表达水平类似，表明Klotho 可能对人体起保护作用，抑制瘢痕疙瘩的形成；MYH9可能在人体肿瘤和瘢痕疙瘩形成方面起促进作用，Klotho 和MYH9可能通过Wnt/β-catenin通路影响瘢痕疙瘩。

综上所述，瘢痕疙瘩患者瘢痕组织中Klotho 表达水平升高、MYH9 表达水平降低，二者呈负相关；Klotho 能够抑制瘢痕疙瘩形成，而MYH9 能够促进瘢痕疙瘩进展，其作用机制可能与Wnt/β-catenin 信号通路有关；当Klotho 阴性表达且MYH9 阳性表达时，提示瘢痕疙瘩术后复发风险升高。