低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾生长、体成分与肝胰腺、鳃组织结构的影响

祝华萍，苏家齐，张子军，朱长波*，张 博，李 婷，陈素文

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东省渔业生态环境重点开放实验室，广东 广州 510300；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.鄂尔多斯市水产技术站，内蒙古自治区 鄂尔多斯 017010)

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)属甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)对虾科(Penaeidae)，具有生长快、抗病能力强和出肉率高等优点，是当今世界养殖虾类产量最高的三大品种之一[1-2]。作为广盐性经济物种，凡纳滨对虾在海洋、微咸、低盐度和淡水中均可生长[3]，在我国27 个省、市、自治区均有养殖生产，2019 年淡水养殖产量为6.71×105t，占其养殖总产量的36.97%[4]。同时，凡纳滨对虾也因其广泛的盐度适应性成为内陆地区盐碱水养殖主要的驯养对象之一[5]。

在凡纳滨对虾的内陆养殖过程中，人们往往采用地下咸水调节盐度或直接利用盐碱水资源开展养殖。与海水相比，内陆含盐地下水和盐碱水在化学特性上存在明显差别，其中K+含量较低是其常见的特性之一，影响对虾的生长和存活[6-8]。近年来，学者们以Na+/K+为衡量标准，先后在不同盐度下研究K+对凡纳滨对虾的生长存活、生理代谢的影响，结果表明凡纳滨对虾在不同盐度下对养殖环境中K+浓度的适应范围有所差异[9-12]。Zhu 等[13]研究了水体Na+/K+和盐度的交互作用对凡纳滨对虾生长、饲料转化及养分保存的影响，认为低盐可以提高凡纳滨对虾对钾缺乏的耐受性。目前，关于K+缺乏对凡纳滨对虾影响的研究主要在较高盐度下进行，在低盐环境下的研究仅见于Liu 等[12]利用盐度为4 的地下水，在Na+/K+为14～60 (mg/mg)对凡纳滨对虾生长及生理特性的研究报道。本研究参照正常海水离子组成，在Na+/K+为27～107、盐度为2 的人工咸淡水条件下，开展为期60 d 的凡纳滨对虾养殖实验，并对对虾的生长、体成分以及肝胰腺和鳃组织结构变化进行分析，以期为低盐环境下凡纳滨对虾对K+缺乏的抗逆适应性以及内陆盐碱水养殖供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计与水体调配

实验在中国水产科学研究院南海水产研究所珠海试验基地进行，在充分曝气的自来水中加入不含钾的人工海水素(江西海鼎科技有限公司)调配水体盐度到2，再分别加入不同质量的KCl 调节水中K+的含量，配制不同Na+/K+比的盐度为2的实验用水，实验设置5 个Na+/K+水平：27(A 组，对照组)、47(B 组)、67(C 组)、87(D 组)、107(E 组)。

1.2 幼虾暂养

从基地养殖池塘(盐度4)挑选同一批次、体质健康的凡纳滨对虾幼虾作为实验用虾，分别在5 个350 L 塑料圆桶中各放置100 尾幼虾暂养6 d，暂养水温为(25±1) °C，在暂养期的第2、3 天，分别降低1 的盐度，在盐度2 水平上再次暂养3 d。暂养期间第1～5 天每天按体重的6%投饵2 次。暂养结束后，用滤纸吸去幼虾体表水分，用电子天平称量幼虾体重，最终选取平均湿重为(1.04±0.22) g 的对虾180 尾作为实验用虾。本研究经过中国水产科学研究院南海水产研究所伦理委员会审核，符合实验动物管理和实施要求。

1.3 生长实验

实验管理 对虾生长实验采用5×6 析因设计，每个水族箱(容积60 L，养殖水体40 L)放养实验虾6 尾，每个处理组设6 个重复，采用完全随机分组排列，共计30 个水族箱。为防止对虾跳出逃逸，所有水族箱均用遮网盖住。实验采用静水连续充气的方式，养殖水体中DO>6.0 mg/L，pH 为7.7～8.2，光周期为14 L∶10 D，水温(26.0±1.0) °C，每2 天换水1/2，4 d 全量换水。实验期间日投喂商品对虾饲料(海明威，广东珠海) 2 次(6:00，18:00)，各组饲料在投喂前准确称量，残饵在投饵2 h 后用虹吸法收集，在65 °C 烘干至恒重后保存在-20 °C。每天记录对虾摄食和死亡情况，每间隔10 d 测量1 次体重和体长。实验期满后，分别将各水族箱的虾停食24 h 后称量湿重，用烘箱在105 °C 烘干至恒重，保存在-20 °C 环境下用于体成分测定。

生长指标计算 实验期间，凡纳滨对虾的成活率、相对增重率、特定生长率及饲料系数：

式中，W0为凡纳滨对虾初始湿重，Wt为凡纳滨对虾终末湿重，N0为凡纳滨对虾初始尾数、Nt为凡纳滨对虾实验t天时存活虾尾数，T为实验持续时间(d)。

全虾体成分的测定 对虾的水分含量以烘干前后重量的减少量为准，采用105 °C 烘干至恒重测定(GB 5 006.3—2016)。粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(氮乘以6.25) (GB 5009.5—2016)。灰分含量通过在马弗炉中灼烧(550±25) °C，8 h 后测定(GB 5009.4—2016)。全虾体钾的测定：测定干样于550 °C 灰化，用1%盐酸溶解定容后采用日立-Z5000 火焰原子吸收光谱仪测定K+含量。

1.4 肝胰腺、鳃组织结构

生长实验结束时，取对虾少许肝胰腺以及鳃组织放入Bouin 氏液中固定24 h 后，用乙醇逐级脱水，石蜡包埋后切片，H.E 染色，光学显微镜观察并拍照。

1.5 数据分析

实验结果均采用平均值±标准差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism.8 和SPSS 25 软件进行数据统计分析，利用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 氏方法进行比较检验。为了减小方差齐性，对虾存活率均转化为反正弦函数Asin，在数据不满足方差齐性的条件下则采用Dunnett 氏T3 方法进行比较检验。P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1 低盐水体中Na+/K+对凡纳滨对虾存活和生长的影响

在实验开始后第10～50 天，各实验组存活率无显著差异(P>0.05)，其中对照组A 组在第30 天前无死亡，E 组第10、30、40、50 天的存活率低于其他各组(图1)。在实验结束的第60 天，E 组存活率最低，为44.64%±20.95%，显著低于除C组外的其他3 组(P<0.05)。A 组最高，为70.83%±8.33%，但与除E 组外其他3 组无显著差异(P>0.05)。

图1 低盐水体中Na+/K+对凡纳滨对虾幼虾存活的影响同一时间段上标小写字母不同表示存在显著差异(P<0.05)，下同。Fig.1 Effects of Na+/K+ ratio in low salinity water on the survival of juvenile L.vannameiDifferent lowercase letters on the same time period indicate a significant difference (P<0.05),the same below.

在实验第10 天，E 组体重低于其他4 组并差异显著(P<0.05)。第20 天，C 组体重最大并与A、E 两组差异显著(P<0.05)，E 组体重最低并与各组差异显著(P<0.05)。第30 天时，C 组体重最大并与E 组差异显著(P<0.05)，其他各组间体重无显著差异。第40 天，C 组体重最大，并与除B 组外的其他各组差异显著(P<0.05)，E 组体重低于各组并与B、C 组差异显著(P<0.05)。第50 天，C 组体重最高并与除D 组外的其他各组差异显著(P<0.05)，E 组体重显著低于其他4 组(P<0.05)。第60 天，E 组体重低于其他4 组并差异显著(P<0.05)，其他4 组之间无显著差异(P>0.05) (图2)。

图2 低盐水体中Na+/K+对凡纳滨对虾幼虾体重的影响Fig.2 Effects of Na+/K+ ratio in low salinity water on the body weight of juvenile L.vannamei

低盐水体中不同Na+/K+对凡纳滨对虾养成湿重、增重率、特定生长率和饲料系数影响显著(P<0.05)，C 组养成湿重最高且显著高于E 组(表1)。E 组增重率低于其他各组且差异显著(P<0.05)，C组最高(518.2%)。C 组特定生长率最高(3.04%)，且E 组与其他各组均存在显著差异(P<0.05)。A组和D 组饵料系数与E 组存在显著差异(P<0.05)，其中A 组最小(1.49)，E 组最大(1.85)。

表1 低盐水体中Na+/K+对凡纳滨对虾60 d 生长指标的影响Tab.1 Effects of Na+/K+ ratio in low salinity water on the growth of L.vannamei in 60 days

2.2 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾体成分及体钾的影响

随着Na+/K+的增加，凡纳滨对虾水分含量呈先下降后升高的变化趋势，B 组水分含量最低，并显著低于D、E 组，E 组水分含量最高，并显著高于A、B 组(P<0.05) (表2)。粗蛋白含量B 组最高，E 组最低，且B 组与E 组差异显著(P<0.05)。灰分含量则为B 组最高，D 组最低，且二者差异显著。各组间全虾体钾的含量无显著差异(P>0.05)。

表2 低盐水体中Na+/K+对凡纳滨对虾体成分的影响Tab.2 Effect of Na+/K+ ratio in low salinity water on the conventional nutrient composition of L.vannamei %

2.3 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾鳃组织结构的影响

对照组凡纳滨对虾鳃组织结构完整，细胞排列整齐，细胞结构以及角质层形态结构正常(图3-a)。随着Na+/K+升高，B、C 和D 组的凡纳滨对虾鳃组织角质层增厚，鳃丝间隙变宽(图3-b～d)。E组对虾的鳃组织出现腔内空泡增多、血细胞减少，鳃丝排列紊乱、变形或破损的现象(图3-e)。

图3 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾鳃丝显微结构的影响(a)低盐水体中Na+/K+为27 (对照组)鳃丝，1.角质层，2.血细胞，3.上皮细胞，4.组织间隙，5.入鳃血管，6.出鳃血管；(b)～(d).Na+/K+为47、67、87 鳃丝，示角质层增厚，鳃丝间隙变宽；(e) Na+/K+为107 鳃丝，示腔内空泡增多、血细胞减少，鳃丝排列紊乱、变形或破损。Fig.3 Effect of Na+/K+ on gill filament microstructure of L.vannamei in low salinity water(a) the gill of L.vannamei exposed to Na+/K+=27 (control)in low-salt water,1.cuticle,2.haematocytes,3.epithelial cells,4.tissue spaces,5.in-gill vessels,6.and out-gill vessels;(b)-(d).the gill exposed to Na+/K+=47,67,87,indicating thickening of the cuticle and widening of the gill filament gap.(e)the gill exposed to Na+/K+=107,showing increased vacuolation in the lumen,reduced haemocytes and disorganised,distorted or broken gill filaments.

2.4 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾肝胰腺组织结构的影响

低盐水体Na+/K+为27 时，凡纳滨对虾肝小管形态完整，管腔呈星型，肝细胞结构正常、分布均匀(图4-a)。随着Na+/K+升高，肝小管B 细胞转运泡数量增多、B 细胞体积增大(图4-b～c)。D 组肝小管中少量B 细胞破裂(图4-d)。E 组的肝胰腺中B 细胞数量增加，肝小管管腔明显变形，少量B 细胞破裂(图4-e)。各处理组F 细胞数量无明显变化，R 细胞(甲壳动物肝胰腺的贮藏细胞)数量无显著变化。

图4 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾肝胰腺显微结构的影响(a) Na+/K+为27 (对照组)肝胰腺小管，示凡纳滨对虾肝小管结构完整，1.管腔呈星型，2～4.肝细胞结构正常，分泌细胞、纤维细胞和吸收细胞分布均匀；(b) Na+/K+为47 肝胰腺小管，5.转运泡数量增多；(c) Na+/K+为67 肝胰腺小管，示B 细胞体积增大；(d) Na+/K+为87 肝胰腺小管，示少量B 细胞破裂；(e) Na+/K+为107 肝胰腺小管，示肝小管管腔变形，B 细胞数量增多，少量B 细胞破裂。Fig.4 Effect of Na+/K+ on the microstructure of the hepatopancreas of L.vannamei in low salinity water(a) hepatopancreatics of L.vannamei exposed to Na+/K+ 27 (control) in low salinity water,1.intact hepatic tubule and star-shaped lumen,2-4.normal hepatocyte structure and uniform distribution of secretory,fibrous and absorptive cells.(b) hepatopancreatics of L.vannamei exposed to Na+/K+ 47,5.an increase of transit vesicles.(c) hepatopancreatics of L.vannamei exposed to Na+/K+ 67,showing the increase in the volume of some B cells.(d) hepatopancreatics of L.vannamei exposed to Na+/K+ 87,showing a small number of B cells ruptured.(e) hepatopancreatics of L.vannamei exposed to Na+/K+107,showing a deformed lumen,a small number of B cells ruptured and an increased number of B cells.

3 讨论

3.1 Na+/K+对凡纳滨对虾存活和生长的影响

钾作为水生动物体内的常量元素，在参与营养物质消化、维持机体电解质平衡以及提高生长和繁殖性能等方面发挥着重要作用[14]。由于实际养殖中地下水的盐度因地区变化而不同，相比研究某种单一离子的特定浓度，以离子比例为指标研究离子对养殖生物的作用更为合适，因此，学者们多以Na+/K+为衡量标准研究养殖环境以及饲料中钾含量的适宜范围[15-16]。朱长波等[17]在盐度为15，Na+/K+为27.7～68.4 的环境开展为期30 d 的养殖实验，结果表明在Na+/K+为27.7～44.8 的环境下的凡纳滨对虾的养成体重、增重率和特定生长率显著高于51.9～68.4 环境下的对虾，Na+/K+为57.8 和68.4 组对虾的食物转化效率显著低于同盐度海水组。Liu 等[12]以盐度4、Na+/K+为60 的地下井水为基础，在Na+/K+为14～60 范围内开展了为期8 周的凡纳滨对虾养殖实验，结果显示Na+/K+为60 组的凡纳滨对虾的饵料系数显著高于Na+/K+为23、33、42 的各实验组，存活率、特定增长率显著低于Na+/K+为23 的实验组。本研究中，在盐度为2、Na+/K+为107 的条件下，凡纳滨对虾的存活率、增重、湿重显著低于Na+/K+为27～87各组，饵料系数则显著高于各组。其他4 组增重率、存活率和饵料系数均无显著差异。上述结果表明，在长期养殖中，较低盐度养殖水体中凡纳滨对虾对Na+/K+异常的适应性要高于高盐度环境，这与Zhu 等[13]的研究结果相似。本研究中E 组对虾饵料系数最高，对虾湿重在第10 日起小于其他组并与大多数组差异显著。表明在极度缺钾环境下可能会引起对虾的食物转化效率下降，从而抑制其生长。此外，各实验组存活率在10～50 d 中无显著差异，表明缺K+胁迫在低盐度下对对虾存活产生显著影响需要较长时间。缺钾对凡纳滨对虾免疫、存活的影响机制有待进一步研究。

3.2 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾体成分的影响

在环境胁迫下，虾类体内的代谢能力增强，某些营养物质会快速耗竭或者合成途径受阻[18-19]。加上动物机体通常自身合成组织蛋白的能力有限，外界吸收到体内的氨基酸又会优先被用于组织蛋白的更新与修复，然后是合成蛋白用于生长发育，最后剩余的部分氨基酸会作为能源被消耗[20-22]。在长期饥饿条件下，凡纳滨对虾仔虾的粗蛋白、粗脂肪含量下降，而水分与灰分明显上升[23]。本研究中E 组对虾蛋白质含量最低、水分含量最高、生长速率最慢，灰分含量与对照组无明显差异，表明高度缺K+的水环境可能引起凡纳滨对虾组织损伤或免疫反应，对虾需要较多的蛋白质来进行修复，同时会对生长发育产生不利影响。Roy 等[24]的研究结果显示，在盐度为4，Na+/K+为29～119的人工盐碱水中，凡纳滨对虾血清钾含量与同盐度淡化海水组无显著差异。本实验中各组虾体内的钾元素含量无显著差异，表明对虾在低渗缺钾环境下仍然通过自身调节以维持体钾的相对稳定。

3.3 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾鳃组织结构的影响

鳃作为气体交换和离子调节的关键部位，通常由鳃轴和鳃叶两部分组成，鳃叶是最基本的功能单位，其由角质层、呼吸上皮和微血腔组成，在水生动物受到环境胁迫后往往最先受到影响并造成损伤[25]。韩晓林等[26]研究表明低盐胁迫会造成三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血腔增大，血细胞增多，上皮层破坏。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)受到低pH[27]或慢性硫酸锌[28]胁迫后，会出现鳃叶肿大，鳃膜和呼吸上皮细胞分离，呼吸上皮细胞坏死等现象。目前，水体中离子缺乏对对虾鳃组织结构的影响尚无报道。本研究结果显示，在正常条件下，凡纳滨对虾鳃叶结构清晰，细胞排列整齐；随着Na+/K+升高，凡纳滨对虾组织结构形态发生改变，包括角质层增厚，红细胞数量变少，鳃小叶间距增大。本实验中，Na+/K+为107 时，鳃组织的结构破坏程度最高。鳃叶角质层出现破裂，使鳃叶更容易受到细菌、病毒的感染或外部不良环境的侵蚀。鳃叶内呼吸上皮细胞的坏死可导致凡纳滨对虾与外界进行物质交换的能力逐渐减弱，影响凡纳滨对虾的生长存活。

3.4 低盐水体Na+/K+对凡纳滨对虾肝胰腺组织结构的影响

肝胰腺是甲壳动物进行解毒、排泄和代谢的重要器官，该器官组织结构的变化反映了机体生理状态的改变。肝胰腺小管是其结构和功能的基本单位，各小管由薄层结缔组织被膜包裹与分隔。肝小管内主要由分泌细胞(B 细胞)、存储细胞(R细胞)、纤维细胞(F 细胞)和胚细胞(E 细胞)构成，其中B 细胞和R 细胞数量较多。已有研究表明，环境的改变可能会引起甲壳动物肝胰腺体的细胞组成比例发生变化，特别是B 细胞和R 细胞[26-27,29]。克氏原螯虾在低pH 胁迫下，肝胰腺B细胞数量增加且其细胞内转运泡体积增大[26]；三疣梭子蟹在低盐暴露下R 细胞减少，B 细胞内转运泡数量增多，体积增大[25]。在本研究中，Na+/K+高于87 时会导致肝胰腺内B 细胞的转运空泡体积增大，并对肝小管结构造成一定的损伤。此外，本研究结果显示，高Na+/K+提高了凡纳滨对虾的饵料系数，而肝胰腺中B 细胞及内部转运泡增多、体积增大也有利于饵料的消化吸收，为其提供更多的能量，表明高Na+/K+可能会促使凡纳滨对虾需要更多的能量物质用于维持自身的基础代谢。实验期间各组凡纳滨对虾摄食正常，肝胰腺组织的R 细胞数量也未发生明显变化，R 细胞可以储藏营养物质并有一定的吞噬作用，表明凡纳滨对虾在面对低钾胁迫时，首先通过依靠外界营养物质提供能量并维持自身离子平衡，较少使用自身储存的营养物质。随着Na+/K+的升高，E 组肝小管结构出现损伤，消化功能减弱，对虾开始利用自身储存的物质抵御低钾胁迫，导致生长速率降低。

研究表明，在盐度2 时，钠钾离子比为107环境下的凡纳滨对虾生长和存活均低于钠钾离子比为27～87 范围内各组。在极度缺钾环境下，凡纳滨对虾肝胰腺小管B 细胞数量增加，小管腔明显变形，鳃组织血细胞减少，小片破损。水体中缺钾在前期即可对对虾的生长产生明显影响，而对存活的影响随着养殖时间的增加而增大。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）