叶面喷施镁对紫米产质量、花青素及代谢物含量的影响

杜雪丽，柯璐瑶，柳 展，代明珠，周 宇，李剑兴，徐玖亮

（1.云南大学 农学院，云南 昆明 650500；2.中国农业大学 资源与环境学院，北京 100080；3.勐海曼香云天农业发展有限公司，云南 勐海 666200）

随着生活水平不断提高，人们越来越注重健康，对营养保健食品的需求不断增加，紫米因其具有多种药理作用和极高的营养价值受到了广泛关注[1]。紫米在我国种植历史悠久，主要分布在云南省、广东省、广西壮族自治区等[2]，是消费量最大的功能稻米[3]。云南省西双版纳傣族自治州是紫米的主要种植区之一，其得天独厚的自然条件非常适合紫米的生长，紫米也成了当地的特色产业。与普通大米相比，紫米富含花青素等功能性物质[2]。花青素是植物中的多酚类天然水溶色素，属类黄酮化合物，主要分布在花、叶、果实、籽粒等组织中。花青素具有抗氧化[4]、预防癌症[5-6]、提高视觉功能[7]、保护心血管系统[8-9]、消炎抑菌[10]、调节免疫[11]、改善记忆力[12]等功能。紫米产量、品质及花青素合成受遗传和外界环境因素的调控，施肥是重要的外界影响因素。李冠男[13]采用田间长期定位施肥试验发现，氮、磷、钾肥配施对提高稻米品质具有较好的促进作用。王宇智[14]在沈阳市辽中区，通过氮肥调控发现，适宜的施氮量能提高水稻产量，促进稻米的加工品质。卢浩宇等[15]研究发现，施氮量150 kg/hm2、配施有机肥比例为50%～75%时，有利于增加紫米的产量，提升品质。赵廷丞[16]研究发现，30%有机肥配施70%无机肥可以提高有色稻产量及籽粒花青素含量。因此，施肥对提高水稻产量、品质及花青素含量具有重要影响。

镁是继氮、磷、钾之后作物必需的第四大营养元素，对作物生长发育有重要影响[17]。镁对作物的叶绿体结构有重要作用，约35%的镁在叶绿体内，可促进膜的垛叠，增强作物叶片光合作用[18-20]。镁对植物的新陈代谢有重要影响，镁是各种酶的基本要素，也是最活跃的组分，与蛋白质、脂肪等物质的代谢和能量的转化密切相关[21]。同时，镁还参与其他物质与结构的形成，例如：碳水化合物分配、能量代谢、蔗糖韧皮部装载、活性氧代谢等[22]。此外，镁在缓解重金属、盐和铝胁迫等非生物胁迫方面也有重要的作用[23]。

目前，关于水稻产量、品质及花青素含量的研究主要集中在氮、磷等大量元素肥料的用量、种类、施用方式[24-27]以及播期[28]、种植密度[29]等的影响方面。与土施相比，叶面喷施能根据不同发育阶段的营养特征，更加灵活地进行追肥，具有用量少、见效快、操作简单等优点[30-31]。但关于叶面喷施镁等中微量元素对水稻的影响研究很少，且主要集中在提高水稻产量、改善品质方面[32]，尚未见对紫米花青素及代谢物含量的影响研究。为此，探究叶面喷施镁对紫米产质量、花青素及代谢物含量的影响，以期为优化紫米栽培措施提供科学支撑。

1 材料和方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验田位于云南省西双版纳傣族自治州勐海县勐遮镇曼根村曼庄小组（100°23'E、21°95'N），海拔1 255.0 m，属于亚热带季风气候，多年平均气温18.4 ℃，年平均日照时间2 113.2 h，年降水量1 301.9 mm，种植制度为水稻—马铃薯轮作，一年两熟制。试验田土壤质地为壤土，0～20 cm 土壤初始pH 值为5.6，有机质含量为33.1 g/kg，速效磷含量为21.0 mg/kg，速效钾含量为146.0 mg/kg，全氮含量为1.9 g/kg，镁含量为71.0 mg/kg.。

供试紫米品种为滇香紫1 号，由云南农业大学和墨江农业技术推广中心共同选育。氮肥为尿素（含N 46%），磷肥为过磷酸钙（含P2O514%），钾肥为氯化钾（含K2O 60%），均购自云天化集团有限责任公司。氧化镁（含MgO 99.99%），购自阿拉丁。

1.2 试验设计

试验设置3 个处理，分别为叶面喷施蒸馏水（CK）、2% MgO（MgⅠ）、3% MgO（MgⅡ），每个处理设5 个重复，随机排列，小区面积为100 m2（10 m×10 m），喷施量为300 L/hm2，分别在抽穗期和灌浆期各喷施1 次。N、P2O5、K2O 施用量分别为180、75、90 kg/hm2，氮肥按照基肥∶分蘖肥∶穗肥=4∶3∶3 施用，磷肥全部用作基肥，钾肥按照基肥∶追肥=1∶1施用。2022 年2 月15 日插秧，种植密度是2.5×106穴/hm2。其他管理按照当地大田管理。

1.3 试验方法

1.3.1 产量及其构成因素测定 在成熟期，取10穴植株，调查穗数、穗粒数、结实率、千粒质量；小区实收，放置阴凉通风处风干，直至水分达到13.5%左右，计产。

1.3.2 加工品质测定 籽粒脱壳、碾磨，按照GB 1350—2009的方法测定糙米率和整精米率[33]。

1.3.3 花青素提取及含量测定 取40 mg 籽粒置于球磨仪中振动研磨3 min，将粉末置于提取瓶中，加入4 mL 预冷提取剂（V乙醇∶V水∶V盐酸=70∶29∶1），旋涡振荡30 s 后超声30 min（4 ℃），-20 ℃静置过夜，取2 mL 上清液用0.22 μm 过滤器过滤后放置-80 ℃冰箱中保存备用。取花青素标品配制成质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mg/L 的系列标准溶液。以标品峰面积为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线。取待检测样本，采用Nexera X2 LC-30AD高效液相色谱（Shimadzu）串联QTRAP5500 质谱仪（AB SCIEX）组成的LC-MS 进行花青素含量测定。所使用色谱柱为ACQUITY UPLC BEH 色谱柱（1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters），流动相：A 液为5%乙腈水溶液含20 mmol/L乙酸铵，B液为100%乙腈。柱温40 ℃，进样量5 μL，流速0.3 mL/min。A液相梯度洗脱程序：0～1 min，95%；1～14 min，95%线性变化到65%；14～15 min，从65%线性变化到35%；15～17 min，35%；17～17.1 min，35% 线 性 变 化 到95%；17.1～20 min，95%。样本队列中每隔8 个试验样本设置1个QC样本，用于对系统的稳定性及重复性进行检测和评价。ESI源参数：ESI电子喷雾电压5 500 V或-4 500 V，毛细管温度550 ℃；离子源加热辅助气40 psi，气帘气50 psi[34]。

1.3.4 代谢组学分析 取80 mg 籽粒，放入球磨仪中振动研磨3 min，加入2 mL 预冷提取液（V甲醇∶V乙醇∶V水=4∶4∶2），旋涡振荡30 s 后超声60 min（4 ℃），-20 ℃静置过夜，在4 ℃条件下16 000×g离心10 min，取上清液用0.22 μm 过滤器过滤后放置-80 ℃冰箱中保存备用，用于检测代谢物含量，同1.3.3用LC-MS进行代谢组学分析。

1.4 数据处理

使用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析；采用Simca-P+ 23 软件对代谢物进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。根据PLS-DA模型获得变量权重值（VIP），将VIP 值大于1 且P值小于0.05的代谢物定义为差异代谢物（SCMs），同时将差异代谢物通过代谢通路数据库京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行注释解析。

2 结果与分析

2.1 叶面喷施镁对紫米产量及其构成因素的影响

如表1 所示，各处理紫米产量表现为MgⅡ＞MgⅠ＞CK。与CK 相比，MgⅠ处理产量显著提高了10.0%，MgⅡ处理产量显著提高了15.8%，但MgⅠ处理与MgⅡ处理产量无显著差异。从产量构成因素看，叶面喷施镁可显著提高结实率和千粒质量，但对穗数和穗粒数无显著影响，与CK 相比，MgⅠ、MgⅡ处理结实率显著提高了3.3%、5.1%，MgⅠ、MgⅡ处理千粒质量显著提高了3.4%、3.0%，但结实率和千粒质量在MgⅠ、MgⅡ处理之间均无显著差异。

表1 叶面喷施镁对紫米产量及其构成因素的影响Tab.1 Effect of foliar spray of magnesium on purple rice yield and its component

2.2 叶面喷施镁对紫米加工品质的影响

如图1 所示，叶面喷施镁对紫米糙米率无显著影响，所有处理均在74%左右；叶面喷施镁能显著提高整精米率，与CK 相比，MgⅠ、MgⅡ处理整精米率分别显著提高了6.9%、5.2%，但MgⅠ、MgⅡ处理之间无显著差异。

图1 叶面喷施镁对紫米加工品质的影响Fig.1 Effect of foliar spray of magnesium on processing quality of purple rice

2.3 叶面喷施镁对紫米花青素含量的影响

本研究在紫米中检测出了3个主要花青素类化合物，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷，其化学结构式如图2所示。

图2 紫米中3种主要花青素类化合物结构式Fig.2 Structure formula of three main anthocyanins in purple rice

如图3 所示，叶面喷施镁显著提高了紫米中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷含量，对矢车菊素-3-O-芸香糖苷含量无显著影响。与CK 相比，MgⅠ和MgⅡ处理矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量分别显著增加了28.9%和23.5%，芍药素-3-O-葡萄糖苷含量分别显著增加了28.5% 和27.6%，但矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷含量在MgⅠ处理和MgⅡ处理间均无显著差异。

图3 叶面喷施镁对紫米花青素含量的影响Fig.3 Effect of foliar spray of magnesium on anthocyanin content of purple rice

2.4 叶面喷施镁条件下紫米中代谢物的主成分分析

本研究，在紫米中共鉴定出182个代谢物，包括氨基酸15 个、苯型烃类7 个、脂类6 个、核苷类35个、有机酸类57个、有机杂环34个和其他代谢物28个。对代谢物进行主成分分析发现，PC1 的贡献率为20.3%，PC2 的贡献率为13.7%。沿着PC1 轴方向分为2 组，第1 组是CK 代谢物，第2 组是MgⅠ处理和MgⅡ处理代谢物；沿着PC2 轴可以将MgⅠ处理和MgⅡ处理代谢物区分开，但不明显（图4A）。

图4 不同处理紫米中代谢物的PCA（A）与PLS-DA（B）分析Fig.4 PCA（A）and PLS-DA（B）analysis of metabolites in purple rice of different treatment

通过PLS-DA 模型进一步分析发现，沿着PC1轴方向，叶面喷施镁处理（MgⅠ处理和MgⅡ处理）代谢物与叶面不喷施镁处理（CK）代谢物有明显差异；沿着PC2 轴方向，MgⅠ处理和MgⅡ处理代谢物有明显差异（图4B）。R2（X）为0.55，R2（Y）为0.99，Q2为0.85，表示模型较稳定、预测能力较好。

2.5 叶面喷施镁与不喷施镁条件下紫米中的差异代谢物分析

本研究最终筛选出42 个差异代谢物（图5），占所鉴定代谢物的23%。其中，MgⅠ处理中有25 个代谢物含量较CK 显著提高，包括羟基异已酸、肌酸酐、3-酰脲丙酸、肌酸、N-乙酰-L-丙氨酸、2-酮-D-葡糖酸、L-苹果酸、乙酰胆碱、2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、L-高丝氨酸、犬尿酸、异冬谷酸、葡萄糖醛酸、天冬酰胺、5-羟基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黄素单核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰赖氨酸；有17 个代谢物含量较CK 显著降低，包括L-半胱氨酸、蔗糖、二羟基丙酮、4-吡哆酸、甘油-3-磷酸、5'-肌苷酸、氨基马尿酸、肌醇、磷酸硫胺素、柚皮苷、β-羟丁酸、焦磷酸硫胺素、2，3-二甲氧基苯甲酸、二磷酸鸟苷、腺嘌呤核糖核苷酸、三磷酸腺苷、乌头酸盐。MgⅡ处理中有16 个代谢物含量较CK显著提高，包括2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、L-高丝氨酸、犬尿酸、异冬谷酸、天冬酰胺、5-羟基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黄素单核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰赖氨酸；有26 个代谢物含量较CK 显著降低，包括L-半胱氨酸、蔗糖、二羟基丙酮、4-吡哆酸、甘油-3-磷酸、5'-肌苷酸、氨基马尿酸、肌醇、磷酸硫胺素、柚皮苷、β-羟丁酸、焦磷酸硫胺素、2，3-二甲氧基苯甲酸、二磷酸鸟苷、腺嘌呤核糖核苷酸、三磷酸腺苷、乌头酸盐、羟基异已酸、肌酸酐、3-酰脲丙酸、肌酸、N-乙酰-L-丙氨酸、2-酮-D-葡糖酸、L-苹果酸、乙酰胆碱、葡萄糖醛酸。这42 个差异代谢物包括有机酸15 个、苯型烃类3 个、氨基酸类4个、脂类3个、核苷酸类3个、有机杂环类7个、其他7个。相对于CK，MgⅠ、MgⅡ处理代谢物含量都显著提高的有16 个，包括2-甲基精氨酸、新蝶呤、苯丙氨酸、苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、L-高丝氨酸、犬尿酸、异冬谷酸、天冬酰胺、5-羟基色氨酸、天冬氨酸、L-肌肽、N-乙酰葡糖胺、精氨酸、黄素单核苷酸、谷胱甘肽二硫化物、N6-乙酰赖氨酸。叶面喷施镁能显著提高紫米籽粒中苯丙氨酸含量。

图5 叶面喷施镁与不喷施镁条件下紫米中差异代谢物分析Fig.5 Analysis of differential metabolites in purple rice grains between spraying magnesium treatment and treatment without magnesium

2.6 叶面喷施镁与不喷施镁条件下紫米中差异代谢物的代谢通路分析

KEGG富集分析（图6）发现，叶面喷施镁与不喷施镁条件下紫米中42 个差异代谢物共富集到10 条代谢通路中，主要包括三羧酸循环、苯丙氨酸代谢、氧化磷酸化、辅因子的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、硫胺素代谢、糖酵解/糖原异生、丙酮酸盐代谢、β-丙氨酸代谢和丙酸代谢。

图6 叶面喷施镁与不喷施镁条件下紫米中差异代谢物的代谢通路分析Fig.6 Analysis of metabolic pathway of different metabolites in purple rice grain between spraying magnesium treatment and treatment without magnesium

3 结论与讨论

3.1 叶面喷施镁对紫米产量和加工品质的影响

在作物生长过程中，镁是必需矿物质元素之一，参与叶绿素合成、光合作用、能量代谢和酶活化等基础性生理过程，土壤中镁的丰缺对植株生长发育和品质的形成有显著影响[34]。施镁对作物产量有显著影响[35]。本研究发现，叶面喷施镁对水稻穗数和穗粒数无显著影响，但显著提高了结实率和千粒质量及产量，这与前人[36-38]研究结果一致。合理施用镁肥能够促进水稻干物质积累，在灌浆期喷镁肥提高籽粒库的生理活性，促进茎叶中碳水化合物向籽粒转运，提高水稻的千粒质量和结实率，实现高产[36]。

施用镁肥可显著改善小麦、大豆、蔬菜、茶叶等的品质[39-41]。大量研究结果表明，喷施镁肥可改善稻米品质，提高糙米率、整精米率[42-45]。王猛[45]研究发现，追施镁肥能提高稻米的加工品质。钱永德[38]研究发现，适量镁肥配合氮肥施用可提高稻米的整精米率和整精米产量。在本研究中，叶面喷施镁显著提高了整精米率，而糙米率无明显差异。这可能是因为稻谷中水分含量较高，其在糙米与稻壳间直接以游离水形态存在，致使在砻谷阶段水分容易损失，最终导致糙米率下降，直接掩盖镁对糙米率的影响[46]，也可能与滇香紫1号品种特性有关。

3.2 叶面喷施镁对紫米中花青素含量的影响

与普通大米相比，紫米富含花青素，具有很高的营养价值和保健功能[47]。花青素稳定性较差且易发生降解作用，很少有游离的花色素存在于自然界中，其主要以花色苷的形式存在[48-49]。通常花青素是以糖苷键与一个或多个糖类物质相连形成花色苷。研究发现，叶面喷施镁肥可提高光合色素含量，促进光合产物生成，为花色苷的合成提供更多底物；此外，Mg2+能与花青素发生螯合作用，使其更加稳定生成螯合物[50]。本研究发现，叶面喷施镁显著促进了紫米中苯丙氨酸积累，这与前人[48]研究结果一致。苯丙氨酸属于芳香族氨基酸，是花青素合成的直接前体物质，在合成花青素的过程中发挥着至关重要的作用[51]。因此，苯丙氨酸含量增加促进了花青素的合成。镁促进紫米中苯丙氨酸代谢，这可能是因为Mg2+作为植物叶绿素的中心原子，是叶绿素的组成成分之一，水稻适量吸收Mg2+能够极大地增强光合作用强度，促进代谢循环[52-53]。同时Mg2+能活化大多数的激酶和磷酸酶，影响蛋白质稳定合成等[54]，从而提高苯丙氨酸裂解酶（PAL）、查尔酮异构酶（CHI）等一系列酶的活性，促进代谢。此外，云南省西双版纳傣族自治州位于云贵高原，水稻季白天温度较高，叶面喷施镁增加水稻中镁含量可以防止高温对其造成有害影响。

综上，叶面喷施镁能提高紫米产量、加工品质和花青素含量，促进三羧酸循环苯丙氨酸代谢、脯氨酸代谢、精氨酸代谢等，显著提高了花青素合成前体物质苯丙氨酸的含量，从而促进紫米中花青素积累。