UPLC-Q Exactive 静电场轨道阱高分辨质谱法同时测定金胆片中6 种成分的含量

金 舒

（无锡市药品安全检验检测中心，江苏 无锡 214028）

金胆片是由龙胆、金钱草、虎杖、猪胆膏制成的复方制剂，具有消炎利胆、清热解毒、排石等作用［1］。方中龙胆有泻肝胆实火、清热燥湿的功效［2］，其主要成分为龙胆苦苷，是龙胆药材质量评价标准之一［3］。金钱草具有清热解毒、利尿、消肿的功效［4］，2020 年版 《中国药典》 对金钱草含量测定的质控指标为槲皮素和山柰酚。金钱草的水提物中，芦丁是含量较高的黄酮苷类成分，且具有较强的生理与药理活性［5］。虎杖具有利胆退黄、清热解毒之功效［6］，其主要成分虎杖苷为质量控制指标。虎杖中的白藜芦醇具有抗氧化、保护心血管等多种功效，与虎杖临床药效密切相关，亦可作为质量控制指标［7］。

金胆片质量标准收载于《卫生部颁标准（中药成方制剂） 》 《国家药品监督管理局国家药品标准》 中，仅有虎杖和猪去氧胆酸的TLC 鉴别，以及龙胆苦苷的含量测定。相关文献仅对金胆片中1～3 种成分含量同时测定，涉及到的药材最多2 种［8-13］，但未有研究对其中3 种及3 种以上中药材主成分进行质量控制。中药检测的指标成分应与其生物活性具有相关性［14］。本研究拟建立UPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱法同时测定金胆片中6 种成分的含量，以期为完善其质量标准提供参考。

1 材料

XS205 电子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）； KH-300E 超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）； Millipore 纯水系统（美国Millipore 公司）； Vanquish 超高效液相色谱仪、Q Exactive 静电场轨道阱液相质谱联用仪 （美国Thermo 公司）。

龙胆苦苷（批号110770-201918，纯度97.1%）、虎杖苷（批号111575-201603，纯度87.3%）、芦丁 （批号100080-201409，纯度91.9%）、白藜芦醇 （批号111535-201703，纯度99.4%）、槲皮素（批号100081-201616，纯度99.1%）、山柰素（批号110861-201812，纯度93.8%）对照品均由中国食品药品检定研究院提供。金胆片为自购市场销售药品（A 厂，批号190605； B 厂，批号20180402；C 厂，批号180502； D 厂，批号181101； E 厂，批号191001； F 厂，批号190528）。甲醇、甲酸为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 色谱 HYPERSIL GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）； 流动相甲醇（A） -0.2% 甲酸（B），梯度洗脱（0～4.00 min，35%A； 4.01～8.00 min，65%A）； 体积流量0.3 mL/min； 柱温35 ℃； 进样量1 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾离子源； 扫描模式t-SIM、PRM、Full MS/dd-ms2； 一级质谱分辨率（R） 70 000 FWHM； 负离子采集； 离子源温度350 ℃； 毛细管电压3.9 kV； 离子传输管温度320 ℃； 鞘气40 unit； 辅助气15 unit； 扫描范围m/z100～1 000； 选择离子检测（t-SIM） 驻留时间200 ms，其他参数见表1。

表1 各成分质谱参数

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品约10 mg，分别置于10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇超声溶解，放冷，甲醇定容至刻度，作为贮备液，精密量取适量，甲醇稀释成每1 mL分别含龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁各20 μg，槲皮素、山柰素各2 μg，白藜芦醇约200 μg 的溶液，精密量取0.3 mL，置于20 mL 棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取金胆片约3 g （5 片，相当于药品的1 次服用量），精密称定，研细，精密加入甲醇100 mL，超声处理15 min，放冷，过滤，精密量取续滤液5 mL，置于100 mL 棕色量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例，分别制备缺龙胆、缺虎杖、缺金钱草的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 专属性试验 取对照品、阴性样品溶液适量，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见图1 ～3，可知各成分互不干扰，表明该方法专属性良好。

图2 对照品溶液中各成分PRM 谱图

图3 各成分t-SIM 色谱图

2.4 线性关系考察 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，采用倍数稀释法依次稀释，在“2.1” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，以信噪比（S/N） ＝3 为检出限（LOD），信噪比（S/N） ＝10 为定量限（LOQ），结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项条件下进样测定6 次，测得龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁、白藜芦醇、槲皮素、山柰素峰面积RSD 分别为1.6%、0.5%、1.4%、1.0%、1.5%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取金胆片（E 厂，批号191001） 适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液6 份，在“2.1” 项条件下进样测定，测得龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁、白藜芦醇、槲皮素、山柰素含量RSD 分别为1.11%、1.40%、1.51%、0.54%、1.47%、0.97%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取“2.2.2” 项下供试品溶液（E 厂，批号191001） 适量，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项条件下进样测定，测得龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁、白藜芦醇、槲皮素、山柰素峰面积RSD 分别为1.2%、1.1%、1.6%、1.0%、1.1%、1.0%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 称取2.5 片各成分含量已知的金胆片（E 厂，批号191001） 粉末9 份，分为高、中、低质量浓度组，每组3 份，分别准确加入相当于各成分含量80%、100%、120%的对照品溶液，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁、白藜芦醇、槲皮素、山柰素平均加样回收率分别为 96.7%、96.8%、96.4%、97.3%、97.9%、97.1%，RSD 分别为 1.7%、1.6%、2.0%、1.9%、1.0%、0.6%。

2.9 样品含量测定 取金胆片6 批，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，平行3 份，在“2.1” 项条件下进样测定，结果见表3。另外，供试品溶液中出现与龙胆苦苷、虎杖苷、芦丁、槲皮素、山柰素、白藜芦醇对照品保留时间一致的色谱峰，对其进行PRM 分析，发现供试品中各色谱峰的二级碎片质谱图均与相应的对照品一致。

表3 各成分含量测定结果（mg/片，n＝6）

3 讨论

本研究考察了不同键合相色谱柱的分离效果，包括Agilent Poroshell EC-C18（4.6 mm × 100 mm，2.7 μm）、Agilent Extend-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），结果显示，HYPERSIL GOLD C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）能使6 种成分均有适宜的保留，峰型均较好。然后，尝试了不同比例甲酸铵-甲醇、甲酸-甲醇、乙酸铵-甲醇等多个流动相体系的梯度洗脱，结果显示，流动相为甲醇-0.2%甲酸时各成分响应、峰形、分离度均较好。再对影响离子化效率的电喷雾离子化源温度、毛细管电压、离子传输管温度、气体流量、碰撞能量等条件进行了优化，确定了最佳质谱条件。在该条件下，龙胆苦苷和虎杖苷虽然在较近的保留时间处出峰，但其各通道之间无明显干扰，均可达到完全分离。

含量分析发现，不同厂家金胆片中各成分含量存在一定的差异，这可能与所用中药材质量及各厂家生产工艺有关。进一步对6 个厂家的供试品进行Full MS/dd-ms2分析，在7.03 min 处均出现m/z431.098 7 准分子离子，在30 eV的碰撞能量下，主要碎片离子为m/z269.045 8，见图4。根据文献［15］ 报道，推测该成分可能为大黄素-O-葡萄糖苷，来源于虎杖。

图4 大黄素-O-葡萄糖苷在各模式下的色谱、质谱图

4 结论

金胆片所含成分种类多，性质差异大，某些含量较低而无紫外吸收，还存在相互作用。由于Q Exactive 质谱仪具有高分辨率，目标选择离子监测（t-SIM） 时通过各分析物的母离子可以进行定量分析。通过平行反应监测（PRM） 确认各分析物的碎片离子，可对化合物进行更为准确的定性［16-18］。本研究采用UHPLC-Q Exactive 静电场轨道阱高分辨质谱技术，结合被测成分的理化性质采用梯度洗脱，同时测定金胆片中各指标成分的含量，发现该方法可在8 min 内快速测定，对保证该制剂质量、安全、有效具有重要意义。