HPLC 法同时测定3 种滑膜炎制剂中9 种成分的含量

彭紫薇，黄嘉怡，李花花，宋 扬，杜守颖，白 洁

（北京中医药大学中药学院，北京 100029）

滑膜炎制剂组方包括夏枯草、女贞子、枸骨叶等13 味中药，具有清热利湿、活血通络功效［1］，广泛应用于膝关节滑膜炎的临床治疗［2-4］，效果明显，副作用少［5-6］，但其含量测定指标仅为“本品每袋/粒/片含丹参以丹酚酸B 计，不得少于2.4/0.8/0.8 mg”，有一定局限性。目前，关于滑膜炎制剂质量研究的报道大多为单一成分HPLC 含量测定，如胶囊中粉防己碱［7］、颗粒/片剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷［8］等，尚未涉及多成分［9-12］。

中药具有多成分、多靶点的特点，故仅靠单一成分评价模糊了其整体特征，脱离了临床实际［13］。近年来，中药质量控制标准也逐步从单一向系统、整体评价转变［14］，有助于在制剂原料环节进行把控［15］，从而实现整体质量批间一致性［16-18］。

课题组在质谱鉴定的基础上，结合滑膜炎颗粒、胶囊、片剂中各成分在HPLC-UV 中的响应值，筛选出迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹参素、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸9 个差异标志物。本实验根据2020 年版《中国药典》 方法，建立HPLC 法同时测定上述成分的含量，以期为滑膜炎制剂质量标准提升提供参考依据。

1 材料

Dionex Utimate 3000 高效液相色谱仪，配置DAD 检测器、CM7.2 色谱工作站［赛默飞世尔科技（中国） 有限公司］。BSA224S、SQP 电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；SB25-12DTD 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）； BY-400C-1 医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）。

丹参素钠 （ 批号 110855-201925，纯度97.8%）、原儿茶醛 （批号110810-201909，纯度99.6%）、绿原酸 （批号110753-202018，纯度96.1%）、咖啡酸 （批号110885-201703，纯度99.7%）、迷迭香酸 （批号111871-202007，纯度98.1%）、丹酚酸B （批号111562-201917，纯度96.6%） 对照品均购于中国食品药品检定研究院。新绿原酸（批号P20A11L121936，纯度≥98%）、隐绿原酸 （批号P16A10U95423，纯度≥98%）、丹酚酸A （批号Z23D10X106625，纯度≥98%） 对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。滑膜炎制剂共38 批，来自5 家公司，具体见表1。乙腈、磷酸为色谱纯（美国Fisher 公司）； 甲醇为分析纯（天津市大茂化学试剂厂）； 水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液

2.1.1.1 滑膜炎颗粒 取本品研细，精密称取2 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入75% 甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz） 处理20 min，取出，放冷，75%甲醇补足减失的质量，摇匀，移取10 mL 至离心管中，10 000 r/min 离心10 min，取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.1.1.2 滑膜炎胶囊 精密称取本品内容物0.5 g，其余操作同“2.1.1.1” 项，即得。

2.1.1.3 滑膜炎片 将本品除去薄膜衣，研细，精密称取0.5 g 或0.6 g，其余操作同“2.1.1.1”项，即得。

2.1.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量，75%甲醇制成分别含丹参素钠0.377 1 μg/mL、新绿原酸0.076 1 μg/mL、原儿茶醛0.079 5 μg/mL、绿原酸0.250 7 μg/mL、隐绿原酸0.072 7 μg/mL、咖啡酸0.082 6 μg/mL、迷迭香酸0.279 7 μg/mL、丹酚酸B 0.400 4 μg/mL、丹酚酸A 0.385 9 μg/mL的贮备液，分别精密吸取1 mL，75%甲醇定容至10 mL，即得。

2.2 色谱条件 Xselect®HSS T3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～3 min，98% A； 3 ～12 min，98% ～90% A； 12 ～19 min，90% ～88% A； 19 ～28 min，88% ～86% A； 28 ～36 min，86% ～83% A；36～42 min，83% ～81%A； 42 ～72 min，81% ～77%A； 72 ～82 min，77% ～75% A； 82 ～100 min，75% ～65%A）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃；检测波长280、287、327 nm； 进样量10 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取对照品溶液适量，制成系列质量浓度，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 取“2.1.2” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得丹参素、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 峰面积RSD 分别为1.51%、0.73%、0.58%、0.64%、0.99%、0.73%、0.66%、0.60%、0.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批颗粒适量，按“2.1.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得丹参素、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 含量RSD 分别为1.44%、1.63%、2.49%、1.54%、2.27%、0.97%、1.17%、1.58%、0.94%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一份颗粒的供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得丹参素、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 峰面积RSD 分别为1.24%、0.63%、1.78%、1.24%、1.34%、1.25%、1.25%、0.87%、1.69%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的颗粒1.0 g，精密加入对照品溶液，按“2.1.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，丹参素、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 平均加样回收率分别为97.05%、98.56%、99.90%、99.37%、98.62%、97.80%、100.35%、98.85%、102.14%，RSD 分别为1.40%、2.59%、2.39%、1.25%、1.37%、1.41%、0.91%、1.50%、1.54%。

2.4 样品含量测定 取10 批颗粒、10 批胶囊、18 批片剂，按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3～5。

表3 滑膜炎颗粒中各成分含量测定结果（mg/袋）Tab.3 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Granules （mg/bag）

表4 滑膜炎胶囊中各成分含量测定结果（mg/粒）Tab.4 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Capsules （mg/capsule）

表5 滑膜炎片中各成分含量测定结果（mg/片）Tab.5 Results for content determination of various constituents in Huamoyan Tablets （mg/tablet）

2.5 结果分析 各批制剂中丹酚酸B 含量均符合2020 年版《中国药典》 要求（颗粒剂不得少于2.4 mg/袋，胶囊剂不得少于0.8 mg/粒，片剂不

得少于0.8 mg/片）。不同批次颗粒、胶囊中各成分含量RSD 分别小于5%、23%； B、C、D 公司片剂中各成分含量RSD 分别小于32%、45%、16%，而E 公司除了咖啡酸含量RSD 小于80%外，其他成分含量RSD 均小于45%。颗粒、胶囊、D 公司片剂批间RSD 较小，表明原料质量稳定，生产过程控制水平较高； E 公司片剂中咖啡酸含量波动较大，可能与工艺参数的控制有关。

在同等生药量（相当于17.04 g 饮片） 下，对不同剂型、厂家样品进行比较，结果见表6，再对不同制剂中各成分综合含量进行评分，结果见表7。

表6 不同滑膜炎制剂中各成分含量测定结果（mg）Tab.6 Results for content determination of various constituents in different Huamoyan preparations （mg）

表7 不同滑膜炎制剂中各成分综合含量评分（分）Tab.7 Scores for comprehensive contents of various constituents in different Huamoyan preparations （score）

综上所述，同一厂家颗粒、胶囊中各成分含量，以及不同厂家片剂中大部分成分含量差异较大。根据2020 年版《中国药典》 滑膜炎颗粒、胶囊、片剂项下内容可知，颗粒和胶囊为同一厂家生产，虽然制法相似，但最终产品规格显示两者浸膏浓缩程度有所差异，可能与浓缩过程中受热时间不同有关； 滑膜炎片由4 个厂家生产，其所含成分的含量差异可能来源于中间体制粒方式、稠膏浓缩程度、药材来源不同。

3 讨论

3.1 检测波长归属 采用DAD 检测器在190 ～360 nm 波长处进行紫外扫描，发现丹参素、原儿茶酸在280 nm 处均有最大吸收，丹酚酸B 在287 nm 处有最大吸收，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸在327 nm 处均有最大吸收。最终确定，检测波长为280、287、327 nm。

3.2 指标成分归属 课题组前期建立了滑膜炎制剂HPLC 指纹图谱，共指认出20 个特征峰，经对照品比对鉴定出17 个，通过HCA、PCA、OPLSDA 等化学模式识别方法［19-22］筛选出迷迭香酸、丹酚酸B、丹参素等9 个差异标志物。本实验发现，丹参素、原儿茶醛主要存在于夏枯草和丹参中，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸主要存在于枸骨叶中，咖啡酸、迷迭香酸主要存在于夏枯草中，丹酚酸B、丹酚酸A 主要存在于丹参中，即各成分归属于不同药材，可为滑膜炎制剂全面质量控制提供参考。

3.3 数据分析 在含量测定时，均以滑膜炎制剂的最小包装为单位，但不同品种最小包装所对应的生药量不一致，故在同等生药量下进行比较。以各指标成分含量排序为打分标准，第一计5 分，第二计4 分，第三计3 分，第四计2 分，第五计1 分，第六计0 分，若排名相等，则取2 个分值的平均值，最终得到综合评分。