大鼠子宫肌瘤模型造模方法研究进展*

杨荣兰 李凤灵 魏 青 彭必龙 徐萌萌

子宫肌瘤是女性生殖系统最常见的良性肿瘤之一[1],好发于性激素分泌旺盛的育龄期妇女,绝经后肌瘤发展停止或缩小,发病率难以准确统计,中国育龄期妇女的患病率约25%,且近年来仍呈上升趋势[2]。其发病机制尚不明确,临床症状多有不相同,亦可无明显症状。常以腹部疼痛、经量增加、经期延长、月经周期缩短、贫血、早产、流产、不孕、压迫直肠或膀胱等为临床表现[1-5]。中医将子宫肌瘤归属于“癥瘕、石瘕”范畴[6]。临床上以手术治疗和药物保守治疗为主,且临床上暂无明显有效药物治疗可以减少平滑肌瘤的大小以及复发的预防。随病情发展,当患者体内子宫肌瘤体积增大,该病存在一定的恶变风险[3]。因此,常用动物造模实验研究该疾病的病因病机、发病机制以及治疗和预防的方法。

子宫肌瘤动物模型的造模方法主要有自发法、基因工程法、移植法和化学诱导法等,由于自发法、基因工程法和移植法需要极高的实验成本以及技术,故动物实验最常用的造模方法是化学诱导法[7]。化学诱导法是指通过化学药物(相关激素)等运用于实验动物诱导构建动物模型的一种方法,现代医学认为该造模方法与子宫肌瘤发生机制中血清雌激素与孕激素水平升高有一定的相似性。化学诱导法比较符合人体子宫中肌瘤生长、发育的过程和疾病发生发展的生理病理机制。动物实验中,以大鼠为造模对象尤其较多,其造模成功率大致有80%[7]。具体方法包括雌激素单模法和雌孕激素双模法,其中雌孕激素双模法又有全程联用和后期加入孕激素的方法。此外,从造模时间而言,有短期造模和长期造模之分,目前尚未有统一标准。文章对这些造模方法的具体差异进行总结,旨在为临床治疗子宫肌瘤提供基础技术和理论支持。

1 大鼠的选择

1.1 大鼠的年龄大鼠子宫肌瘤模型制备成功决定性的因素很多,选择适龄的大鼠也是重要因素之一。因子宫肌瘤的发病人群广,临床表现较多且不明显,具体发病率难以统计,在孕龄期妇女尤为多见,根据现在的社会压力及医学技术的发展,该病发病人群逐渐有年轻化趋势[8]。虽然暂无确切的发病机制,但有不少研究者认为该病的高危因素包括年龄>40岁、 初潮年龄小、未生育、晚育、肥胖、多囊卵巢综合征、 激素补充治疗、黑色人种及子宫肌瘤家族史等[1],以上因素均与子宫肌瘤的发病风险增加密切相关。选取大鼠年龄较小则可能大鼠子宫及平滑肌细胞未成熟,不利于后期观察子宫肌瘤大小;选取大鼠年龄较大则可能大鼠的激素和子宫平滑肌组织中钙神经磷酸酶的活性即达到最高并趋于稳定,因而可能降低其造模成功率。根据子宫肌瘤的发病率多在育龄期妇女,大多研究选择鼠龄在2～8个月,平均鼠龄(4.5±0.3)个月的壮年雌性SD大鼠,也有部分研究使用Wistar品系大鼠[9]。

1.2 大鼠的体质量及基础疾病大鼠的体质量、大鼠是否存在基础疾病,都与子宫肌瘤造模的成功有一定的关系。根据多数大鼠子宫肌瘤的相关研究实验统计得知实验大鼠体质量一般为180～230 g[2,10-12],大鼠年龄及体质量增长选择平均体质量在(210±10)g即可。根据毛惠娟等[4]的研究,子宫肌瘤的发生与代谢综合征包括心血管疾病及糖尿病等指标有一定的关系,其中血清胰岛素样生长因子-1水平、空腹血糖、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇水平是子宫肌瘤发生的危险因素。亦有研究者提出子宫肌瘤的发病机制可能与遗传易感性、性激素水平和干细胞功能失调等存在一定的关系[1]。为实验数据准确性,减少不可控因素和增加造模成功的机率,故可选用健康SD雌性大鼠体质量(210±10)g。

2 造模方法

2.1 雌激素单模法雌激素单模法是指仅用雌激素进行构建子宫肌瘤动物模型的一种方法。此方法也有少数相关研究人员运用,造模周期上也有所不同。张兰兰等[13]使用隔日肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液 0.05 mg /100 g,3 次/周,共计10 周的造模方法,子宫系数、子宫分角下及分角根 部横径、子宫平滑肌厚度显著增大。陈智昌等[14]、周立等[7]采用苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg),每周3次,连续12周给大鼠腹腔注射进行模型构建。此造模方法与正常组比较,模型组子宫系数和雌激素水平均有增加,子宫平滑肌厚度以及血浓度均有一定上调。单一的雌激素造模剂量、造模周期与子宫肌瘤发生率也呈正相关,同时雌激素运用的频率与动物病死率也呈正相关的关系,但整体造模成功率可达60%左右。

2.2 雌孕激素双重造模法雌孕激素双模法是指运用雌激素以及孕激素构建子宫肌瘤动物模型的一种方法,该造模方法更符合现代医学认为的子宫肌瘤与雌孕激素水平升高存在一定关系的作用机制,造模的成功率也有一定上升。双模法造模子宫平滑肌细胞增生活跃程度更高,成模后表现更为稳定[10],且与子宫肌瘤的发病原因相吻合,更容易观察到药物的治疗作用。雌孕激素双模法从激素的使用情况看,有全程联用和后期加入孕激素之分,从造模周期的长短看,存在长期与短期双模法之分。此外,还有雌孕激素负荷结合多因素刺激造模的方法,以期更好地模拟人类患子宫肌瘤的过程。

2.2.1 雌孕激素全程联用法雌孕激素全程联用是全程以雌激素和孕激素同时参与造模。因目前子宫肌瘤造模方法尚未统一,采用的药物、剂量以及频次等都存在差异。较为常见的短期雌孕激素全程联用造模法是每天腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg连续30 d,期间每周注射1次孕酮注射液4 mg/kg,最后 5 d 2种激素同时注射,剂量不变[15-20]。雌孕激素全程联用法造模在一定的程度上符合了马林纳等[21]的激素异常分泌,使孕激素介导和推动了子宫肌瘤生成的观点。

造模周期较长的方法,如李亚梅等[22]应用持续8周每周肌内注射3次(周一、三、五)黄体酮(1 mg/kg)和3次(周二、四、六)苯甲酸雌二醇(2 mg/kg)造模的方法,通过雌激素和孕激素的交叉干预成功建立了大鼠模型。虽然在造模过程中出现了8只大鼠死亡,但雌激素和孕激素通过激活相应受体诱导了细胞增殖和分化,从而促进子宫肌瘤细胞有丝分裂和子宫肌瘤的发生。造模周期相同也有可能在浓度和频次上有差异。王家平等[23]则连续8周对大鼠双腿每日交替注射0.1 ml黄体酮和乙烯雌酚注射液进行造模。造模模型组子宫系数显著增加,子宫平滑肌肌层显著增厚,伴有局灶性增生,达到预期效果。另有更长周期造模法,使用的是乙烯雌酚和黄体酮配合造模,方法是每周肌内注射己烯雌酚(0.4 mg/ml)0.1 ml;和黄体酮(10 mg/ml)0.1 ml[24], 共 15 周建立子宫肌瘤模型,造模效果良好。

2.2.2 后期加入孕激素法雌孕激素双模法造模后期加入孕激素是相当于将造模分为2个阶段,第1个阶段运用的雌激素,第2个阶段在第1个阶段的基础上加入孕激素参与造模。与雌孕激素全程联用法相比,相同造模周期与剂量的前提下,后期加入孕激素法在孕激素加入的时间上进行了调整。方法是每天1次腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液 0.5 mg /kg连续25 d后,改为每天1次腹腔注射黄体酮注射液4 mg/kg,连续 5 d[25,26],此法造模组织学变化和临床子宫肌瘤病理组织学相似,较为常用。另有研究者在剂量和造模周期又有些许不同,苯甲酸雌二醇溶液(0.5 mg/kg)的注射时间增至28 d,再以相同剂量的黄体酮加入,连续 5 d 造模,共计33 d[27]。

此外,还有造模周期更长的造模方法,周期有8周、12周、16周和20周之分。如杨敏春等[2]应用每周2次肌注苯甲酸雌二醇注射液1 mg/kg的剂量连续8周肌注,于第5周起加用黄体酮注射液5 mg/kg每周2次肌注至第8周进行造模。12周造模法则是每周3次肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg连续注射8周后,再每周2次腹腔注射黄体酮注射液4mg/kg连续注射4周,共计12周进行造模[28,29]。16周造模法是3次/周肌肉注射苯甲酸雌二醇溶液0.06 ml/只(含药量0.12 mg)16周,于第10周起2次/周加黄体酮注射液0.05 ml/只(含药量1 mg)[30];或者黄体酮注射周期缩短为4周[31]。20周造模法,每周3次肌内注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 mg/100 g,共 20 周; 第 14 周至20周2次/周,加注黄体酮注射液0.04 mg/100 g,共7周[11, 32],同样也能达到造模预期效果。

吴晓贞等[10]比较了12周全程联用法和后期加入孕激素法造模效果的差异,发现全程给药、后期加入孕激素组法均能成功制备子宫肌瘤大鼠模型,其中全程联用法较优。综上所述,后期加入孕激素造模与雌孕激素全程联用造模方法在一定程度上均能表现出大鼠子宫平滑肌不同程度的增生,大鼠血清和子宫中ER与PR水平均有显著的上升趋势,但效果稍逊于全程联用法。

2.2.3 雌孕激素负荷结合多因素刺激法另有少数研究者使用雌孕激素负荷结合多因素刺激法建立子宫肌瘤模型,如有研究[33,34]运用己烯雌酚药液以每天每只1.35 mg·kg-1的量进行灌胃,再以3次/周的频率对每只鼠肌注1.0 mg黄体酮注射液连续5周进行造模;同时于第4周起对每只大鼠进行0.9 mg·(kg·d)-1盐酸肾上腺素注射液皮下注射,并每周随机选用以下2种刺激:噪音刺激、冰水浴游泳、昼夜颠倒、悬尾等。该造模方法虽然耗时耗力,但从中、西医学的角度观察该造模方法较贴近人类患子宫肌瘤的过程。另有何嘉伦等[35]每天1次肌肉注射苯甲酸雌二醇 0.1 mg,每周3次肌肉注射黄体酮1 mg,并每天饲喂高糖高脂饲料,连续5周进行性激素刺激协同胰岛素抵抗的方法建立子宫肌瘤模型,造模效果基本与临床子宫肌瘤患者的病理改变一致。

3 总结与展望

综上所述,常用苯甲酸雌二醇、己烯雌酚和黄体酮等激素药物构建大鼠子宫肌瘤模型。其中应用雌激素单模法造模的较少,该方法多使用苯甲酸雌二醇构模;而应用雌孕激素双模法造模在化学诱导模型中占的比例较大。雌激素单模法应用的雌激素均为苯甲酸雌二醇,而雌孕激素双模法多是苯甲酸雌二醇和黄体酮搭配运用参与造模,少部分运用己烯雌酚和黄体酮搭配构模。子宫肌瘤模型构建的方法尚未统一,在雌孕激素双模法中存在造模周期长短之分,长则有20、16、15、12周,短则有1个月甚至7 d之短。因为造模周期的长短不一,所以药物种类、剂量、频率也存在较大的差异以及较多的选择。大部分还是以10～16周为造模周期,小部分采用30 d以内频率,不过近年来短期造模的使用也不断在上升。虽激素药使用的剂量和频率以及使用的周期各有不同,但该造模方法的成功率也在使用中不断上升。

综合不同研究,采用的大鼠子宫肌瘤模型造模方法、药物、药物剂量、药物的使用频率及造模周期等,发现构建子宫肌瘤模型采用的基本原理是使雌激素和孕激素水平异常升高来推动子宫肌瘤生成,最常用的造模方法是雌孕激素双模法。该文旨在为后续临床研究获取更有价值的研究成果提供基础理论支持。