宫颈癌中循环肿瘤细胞检测的研究进展

苗鸣殊,孙鸿妍,张晓天,贺思思,任浩文,杨 梅,朱洪权*

(1.吉林大学白求恩第二医院 检验科,吉林 长春130022;2.吉林大学基础医学院,病理生理系,吉林 长春 130021)

宫颈癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,2020年全球癌症统计报告表明,宫颈癌的全球新发病例为60.4万例,死亡人数达34.1万人[1]。近年来,我国女性宫颈癌的发病率和死亡率也逐年增高,同时发病人群趋于年轻化[2]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的持续感染是诱发宫颈癌的主要原因,其中以高危型HPV16和HPV18为主[3]。宫颈癌具有早期无自觉症状、发病隐匿及易复发和转移的特点,患者出现临床症状时大多数患者已错过最佳治疗时期,因此疗效和预后较差。复发转移是宫颈癌患者死亡的最主要的原因之一,许多研究表明在早期就可能出现肿瘤的转移。目前预测复发转移的指标有肿瘤直径大小、国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期及浸润深度等,然而该类指标都是术后获取的信息,对于高危病人的及时诊断和病情的精准评估存在限制[4]。因此,寻找一种可早期反应患者复发转移的生物标志物是十分重要的。目前,新兴的液体活检中对循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的检测可早期反映转移复发、评估预后、判断疗效、指导个性化治疗,具有丰富的临床应用价值[5]。

1 CTC生物学特性

CTC是指自发或因诊疗等因素从原发肿瘤或转移病灶脱落,释放入外周血液的肿瘤细胞[6]。在循环中逃避免疫监视等影响的CTC向继发性部位外渗,最终导致远处器官的转移性病变[7]。大部分的CTC通常由于物理剪切力、细胞死亡、免疫监视、缺乏生长因子等综合因素在血液中很快被清除,只有少数CTC处于休眠状态而存活[8]。因此,CTC具有稀缺性。此外,CTC以单个细胞或细胞簇的形式存在,其中CTC簇称为循环肿瘤微栓子(Circulating Tumor Microemboli,CTM),CTM的数量相对于CTC更为稀少,但CTM的转移能力比单个CTC高23～50倍[9],且持续存在的可能性更大,可作为提示患者预后不良的指标[10]。CTC具有上皮-间充质可塑性,可从外周血中分离出上皮、间充质或双杂合上皮/间充质表型[11]。其中双杂合上皮/间充质表型的CTC成簇能力高、存活时间长且有较强的成瘤能力[12]。CTC先后通过上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和间充质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition,MET)完成肿瘤的转移和播散,EMT过程使CTC的侵袭能力增加并且促进CTC的内渗,有助于其在循环过程中存活[13]。MET这一过程使CTC的上皮特性和迁移能力丧失,从而在远处器官定植[14]。

2 CTC的检测方法

因肿瘤患者外周血中CTC含量极低,每106～107个白细胞中可能只存在1个CTC,同时外周血中的大量血细胞还会干扰CTC的检测,因此首先要通过富集提高检测效率,继而对富集的细胞进行下一步的检测和鉴定[15]。CTC的富集主要包括基于物理学特性和基于生物学特性的两种富集方法,基于物理特性的富集方法是根据CTC与外周血细胞之间的物理特性差异进行富集,包括尺寸[16]、电介性、惯性、密度及变形能力[17]等,但是这类方法的灵敏度和特异性较低[18]。基于生物特性的富集方法包括靶向上皮细胞黏附分子、细胞角蛋白等肿瘤细胞上的标志物进行的阳性选择和靶向具有CD45等常见白细胞生物标志物以去除其他血细胞的阴性选择[19]。这种基于抗原-抗体识别的富集方法特异性较高,是分离富集CTC的常用方法。CTC体外检测鉴定方法主要分为细胞计数法和核酸检测法两种,其中细胞计数法包括流式细胞技术、免疫荧光染色法[20]及免疫荧光原位杂交技术等,核酸检测法包括聚合酶链反应和逆转录聚合酶链反应等。此外,目前新兴的CTC体内检测方法包括在体荧光流式细胞术和在体光声流式细胞术等,它们实现了非侵入性的实时监测CTC,是体内定量和分析循环肿瘤细胞的新技术[21]。由于CTC的稀缺性和异质性,导致对CTC的检测仍存在一定困难,未来发展更高灵敏度和特异性的检测技术可以进一步实现CTC的精准捕获。

3 CTC检测在宫颈癌中的应用

3.1 发现早期微转移

CTC是肿瘤转移过程中原发肿瘤和转移性肿瘤之间重要的枢纽,保留着与原发肿瘤相似的生物学特性。研究表明CTC检测可以辅助诊断肿瘤的转移和复发。LAW等[22]研究了一种基于生物芯片的微流控装置检测宫颈癌患者体内的CTC,在对术后患者进行随访时观察到患者外周血中人表皮生长因子受体2(HER2)的表达,但此时没有临床表现,肺部PET-CT扫描诊断也不明确。在初步诊断12个月时,才产生了宫颈癌转移的组织学证据。因此,对患者进行CTC检测有助于早期发现肿瘤转移的发生。PAN等[23]研究了90例I-IIA期宫颈癌患者的CTC表型,结果发现上皮型CTC占38.89%,间充质型CTC占23.33%,混合型CTC占14.44%,除此之外,间充质CTC在FIGO II期、盆腔淋巴结转移、淋巴血管受累的患者中更常见,因此,具有间充质表型的CTC与I-IIA期宫颈癌的盆腔淋巴结转移和淋巴管浸润密切相关,检测CTC表型有助于宫颈癌微转移的早期诊断和病情评估。HR-HPV E6/E7是人乳头瘤病毒的早期转录基因,可作为检测宫颈癌患者外周血中CTC的独特生物标志物。WEISMANN等[24]对宫颈癌患者外周血中CTC的HR-HPV E6/E7致癌基因进行了检测,结果显示表达HR-HPV E6/E7致癌基因的CTC是宫颈癌患者早期微转移的特异性基因标志,有助于提示早期微转移的发生。

3.2 判断患者预后情况

CTC的存在反映了肿瘤转移的潜能,而肿瘤转移与患者较低的生存率相关,因此对CTC计数有助于判断患者的预后情况。DU等[25]选取了107例经过放疗或同步顺铂化疗之后的宫颈癌患者,探究了CTC水平与无进展生存期(PFS)之间的关系。结果显示其中有86名患者CTC阳性且中位PFS为43.1个月,进一步研究发现每3.2 ml血液中检测到≥1个CTC的患者的PFS短于未检测到CTC的患者的PFS,多因素分析表明经过放疗或同步顺铂化疗后的宫颈癌患者的CTC计数是预后评估的独立预测因素。因此,宫颈癌患者经过治疗后体内的CTC水平是独立的预后指标。鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是宫颈癌诊断、预后评估过程中使用广泛的肿瘤标志物,SSC-Ag与CTC联合检测可以达到更好的预后评估效果。WEN等[26]研究了治疗前CTC和SSC-Ag水平与晚期宫颈癌患者生存率之间的关系,结果显示,每3.2 ml血清中CTC水平<3个和每3.2 ml血清中CTC水平≥3个的患者两年DFS率分别为71.3%和40.6%,因此得出治疗前高水平的CTC与较差的DFS显著相关的结论。此外,研究还表明CTC联合SCC-Ag的检测结果与局部晚期宫颈癌患者的DFS相关,而且建立了一种CTC和SCC-Ag联合应用预测宫颈癌患者疾病进展的风险模型,该模型是计算每个病例的CTC评分和SCC-Ag评分之和得出新的联合风险评分,其预测患者疾病进展的效能与单一生物标志物的预测效能相比显著提高,这一模型可能有助于改善宫颈癌患者的预后分层,以便准确地判断预后。

3.3 动态监测疾病进展及指导治疗

监测宫颈癌患者的疾病进展和指导个性化治疗是治疗过程中关键的环节,CTC的检测不仅可以帮助监测疾病进展而且还有助于判断药物的疗效。TEWARI等[27]通过动态监测宫颈癌患者外周血CTC的水平进而探究了贝伐单抗治疗对晚期宫颈癌患者的疗效。研究发现,治疗前外周血CTC的中位数为7CTC/7.5 ml全血,治疗36天后外周血CTC中位数下降至4CTC/7.5 ml全血,这表明了CTC的检测可以对治疗过程中的宫颈癌患者进行实时监测和疗效的动态评估。此外,CTC检测还可以帮助选择治疗药物,在接受顺铂-紫杉醇化疗的治疗前CTC较高的女性患者中,同步使用和不使用贝伐单抗的患者的中位PFS分别为14.6个月和6.4个月,所以治疗前CTC数量较多且同时接受顺铂-紫杉醇化疗和贝伐珠单抗治疗的患者PFS显著改善。因此,CTC的检测不仅可以动态监测患者疾病的进展还有助于对治疗药物的选择。此外,寻找一种灵敏度较高的检测方法对实时动态监测患者的疾病进展是十分重要的。PFITZNER等[28]建立了一种基于HPV癌基因转录物的敏感测定法Digital-Direct-RT-PCR,它是将Ficoll分离、细胞固定和一步RT-PCR以低通量数字PCR形式结合,使得可以直接分析和检测单个CTC而不需要分离RNA。该方法可以在高背景的HPV阴性细胞中分离出数量少的HPV16/18-E6表达的细胞,这种灵敏度较高的检测方法可以更好地实现对宫颈癌患者体内的CTC水平进行动态监测,从而实现对患者的个性化治疗。

4 小结

宫颈癌作为女性生殖系统常见的恶性肿瘤,严重威胁着女性的生殖健康和生活质量,早期发现和诊断是患者良好预后的关键。目前临床上检测和诊断宫颈癌的主要方法包括电子计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等影像学检查,薄层液基细胞检测(TCT)、组织活检等病理学检查,但是缺少与宫颈癌相关的高灵敏度和高特异性的肿瘤标志物。液体活检作为一种新兴的检测技术,它包括CTC、循环肿瘤DNA和外泌体等检测。其中CTC是液体活检的基石之一,其检测具有微创、实时、便捷、灵敏的优点,是一种十分有前景的生物标志物。CTC已被证明与肺癌[29]、乳腺癌[30]、结直肠癌[31]及胰腺癌[32]等其他许多实体肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后评估相关,虽然CTC的检测在妇科恶性肿瘤方面仍处于探索阶段,但是现有的研究发现宫颈癌患者外周血中CTC的检测也具有丰富的临床应用价值,包括在早期诊断微转移、判断患者的预后情况、动态监测和评估患者的疗效等方面。未来将CTC的体外培养和CTC的靶向治疗与宫颈癌相结合,可能会使CTC在宫颈癌的诊治中具有更加广泛的应用前景。