发酵稻壳通过增强氮代谢途径影响烟草幼苗的生长发育

张 斌,袁志辉,彭陆军,周向平,周德英,王锡春,*

(1.湖南科技学院 湖南省银杏工程技术研究中心,湖南 永州425199; 2.永州市思源农业科技有限公司,湖南 永州 425000; 3.湖南省烟草公司永州市公司,湖南 永州425000)

育苗是烟叶生产的重要环节,而漂浮育苗是当前我国育苗的主要方式之一[1]。烟草漂浮育苗技术的应用促进了烟草育苗工厂化。炭化稻壳具有容重小、质量轻、孔隙度高、通气性好和保水力强等优点,目前已成为烟草漂浮育苗基质的主要成分[2],仅永州市每年就需要5 000 m3。然而,制备炭化稻壳的煅烧过程中会产生大量烟雾,近来引起了环保部门关注,因此,寻找烟草漂浮育苗基质中炭化稻壳的替代物成为集约化烟草育苗急需解决的问题。近年来,我国各大烟区开展了一些利用农业废弃物开发漂浮育苗基质的研究,如蔗渣[3]、花生糠[4]、药渣[5]等,并取得到了较好的效果,但由于原料的产地限制难以进行大面积推广。

稻壳的主要成分为纤维素、木质素和硅[6],对离子具有良好的吸附能力[7],它能够提高土壤透气性,具有改良土壤结构的功能。我国稻壳资源丰富,取材方便,却未得到充分利用[8]。稻壳发酵后可消除致病菌,且含有丰富的有机质和矿质元素,理论上可以作为育苗基质,有较大的推广价值。陈雪娇等[9]对稻壳和油枯进行发酵,认为添加40%磷石膏的基质更适合用于作物栽培;于艳辉等[10]研究表明,发酵后稻壳营养元素含量变化不明显;尚秀华等[11]研究表明,稻壳经过腐熟处理后容重和持水量等理化性能有所改良,其有机物得到不同程度的降解;韩道杰等[12]研究了基质中发酵稻壳添加量对西瓜幼苗生长的影响,发现添加50%(体积分数)的发酵稻壳可达到优秀基质的标准;谢晓梅等[13]研究表明,发酵稻壳对Fe2+和S2-具有较好的吸附能力和环境适应性,吸附态Fe2+和S2-稳定性好,不易再释放;徐经年等[14]研究表明,发酵稻壳、高温消毒熟土和膨化珍珠岩按体积比6.0∶2.5∶1.5混合制成的基质可以替代烟漂浮育苗的商品基质;徐昱松等[15]研究表明,腐熟稻壳、蛭石和珍珠岩体积比为6∶2∶2时适宜黄瓜育苗。虽然周德英等[16]研究发现,含40%(体积分数)发酵稻壳的基质对烟苗生长具有促进效果,但是,有关发酵稻壳对烟苗生长发育影响的相关分子机理研究还鲜有报道。本研究以发酵稻壳为材料,对烟苗生长发育与相关生理指标进行了测定,对相关代谢途径进行分析,鉴定了代谢通路中的关键基因,并对其进行了验证,研究结果可为发酵稻壳的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试供烟草品种为湘烟7号;发酵助剂由永州市烟叶生产技术中心提供;发酵稻壳为自制,将稻壳、尿素、玉米粉、发酵助剂按质量比1 000∶5∶5∶4配制发酵液,稻壳粉碎后过3目筛,掺水达60%后拌匀发酵液,用塑料膜覆盖,堆垛发酵30 d,其间翻堆3次,待稻壳呈棕褐色即可。漂浮育苗基质由永州市思源农业科技有限公司按照表1生产。

表1 基质组成

1.2 试验设计

试验于2021年12月至2022年3月在湖南省烟草公司永州公司技术中心基地玻璃钢架育苗棚内进行,共设置6个处理(基质配方见表1),每个处理设3次重复,每个重复1个育苗盘(100孔穴),每穴基质用量为10 cm3。将饱满种子在室温浸泡4 h后播种至育苗盘(每孔穴1粒),漂浮育苗。除栽培基质外进行常规管理,其他环境条件保持一致。

1.3 测定指标与方法

栽培60 d后,参照YC/T142─2010《烟草农艺性状调查测量方法》的方法,每个处理随机取15株苗,测量株高、根长、茎粗、地上部鲜重、地下部鲜重、地上部干重、地下部干重。株高为幼苗根部至主茎顶点的距离,根长为最长根的长度,用0～10 cm的直尺测量。茎粗为栽培基质处茎的直径,用游标卡尺测量。幼苗洗净吸干水分后测量地上部鲜重和地下部鲜重;120 ℃烘干至质量不变,用万分之一电子天平测量地上部干重和地下部干重。根冠比=根鲜重/地上部分鲜重;壮苗指数=(茎粗/株高+根干重/地上部干重)×全株干重。按照试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)的方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量;采用中晶科技扫描仪(MRS-9600TFU2L)测定根系指标。按照硝酸还原酶(NR)活性检测试剂盒和亚硝酸还原酶(NiR)活性检测试剂盒说明书(合肥莱尔生物科技有限公司)测定NR和NiR活性;在连续流动分析仪上测定根系总氮含量。

1.4 转录组测序和分析

1.4.1 样品处理

以CRH处理为对照,选择FRH1处理进行转录组测序,每个处理设3次重复,每个重复随机采集6株幼苗根系,快速混合均匀,标记为FRH1-1、FRH1-2、FRH1-3和CRH-1、CRH-2和CRH-3。用铝箔纸包扎后放入液氮,送北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序;剩余样品保存在-80 ℃,测定SOD、CAT、NR和NiR活性,以及Pro、MDA和总氮含量。

1.4.2 测序和数据分析

使用百迈客云平台提供的分析流程分析测序后的数据。参考基因组为(Nicotiana_tabacum.Ntab_K326),采用HISAT 2.0软件进行序列比对。基因表达量采用FPKM值,用DEseq 2软件筛选显著差异表达基因,参数设定为差异倍数|log2(fold-change)|≥1.5且Pvalue≤0.05。利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)进行显著差异表达基因功能注释。

1.4.3 关键基因qRT-PCR验证

采用试剂盒(北京聚合美生物科技有限公司)提取剩余样品RNA,并反转录成cDNA,进行qRT-PCR检测。在NCBI网站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)设计基因特异引物,内参基因为β微管蛋白基因(基因ID为gene_1665)(表2),在美国伯乐CFXConnect上进行扩增。反应体系10 μL:上下游引物各0.4 μL,1 μL cDNA,SYBR greenMix 5 μL,ddH2O 3.2 μL;反应程序:94 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,45个循环。每个样品3次重复,采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。

表2 qRT-PCR分析的基因与引物

1.5 数据分析

试验数据采用Excel软件(2019版)进行统计分析,用t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵稻壳对幼苗生长势和形态指标的影响

不同处理烟草幼苗栽培60 d时的生长势和形态指标见图1。相同处理的烟草幼苗生长比较齐整,6个处理间整齐度差异不大,但FRH处理的烟草生长势优于CRH处理(图1-A);FRH处理的幼苗高度、根冠比和壮苗指数优于CRH处理。与CRH处理相比,FRH1、FRH2、FRH3、FRH4和FRH5处理的幼苗高度分别提高了51.7%、37.9%、34.5%、20.7%、31.0%,除FRH4的株高外,其他处理都显著性高于CRH处理(图1-B)。各处理中根冠比和壮苗指数排序为FRH1>FRH3>FRH4>FRH2>FRH5>CRH处理,FRH1和FRH3的根冠比和壮苗指数显著大于CRH处理(图1-C和图1-D)。综合比较,FRH1处理在株高、根冠比和壮苗指数方面优于其他处理。

A,生长势。CRH,炭化稻壳;FRH,发酵稻壳。柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。A, Growth potential. CRH, Carbonized rice husk; FRH, fermented rice husk. Bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.

2.2 发酵稻壳对幼苗一级侧根和根系生理指标的影响

如表3所示,FRH1处理的烟草一级侧根的数量、长度、直径和表面积分别为292根、39.7 mm、0.066 mm和4.9 cm2,除直径外,其他指标都显著(P<0.05)高于CRH处理。与CRH处理相比,FRH1处理的烟草脯氨酸含量显著下降33.5%,CAT和SOD活性分别显著(P<0.05)上升13.6%和68.5%,根系MDA含量无显著差异(P>0.05)。

2.3 转录组测序数据的质量

经过净化和质量过滤后的转录组数据如表4所示,所有样品碱基百分比(Q30)≥94.29%,GC含量不低于43.12%,测序质量较高。测序数据与参考基因组的比对率和单一比对率分别为95.29%～93.89%和93.21%～91.68%,比对质量比较高。

表4 转录组测序数据质量分析

2.4 样本中基因表达一致性检验

主成分分析显示,2个处理的特征向量分别为75.71%、15.46%和8.04%,不同处理之间具有一定的差异(图2-A);相关性分析显示,处理内样本间相关系数r超过0.90,处理间相关系数低于0.20,样本CRH-1、CRH-2和CRH-3聚在一起,FRH1-1、FRH1-2和FRH1-3聚在一起,说明处理内样本间生物学重复的相关性较强,处理之间具有一定的差异(图2-B)。

A,主成分分析图;B样品相关性分析图。A, Principal component analysis chart; B, Sample correlation analysis chart.

2.5 显著差异表达基因功能注释、关键基因鉴定和验证

对2个处理进行差异表达基因分析,共有476个显著差异表达基因,其中311个基因表达上调、165个基因表达下调(图3-A)。在KEGG数据库中共鉴定出294个基因,它们参与20个代谢通路(图3-B)。其中氮代谢途径(ko00910)数据以鲜重计。

A,火山图;B,KEGG富集分析。A, Volcano diagram; B, KEGG pathway enrichment analysis.

富集差异最显著(Qvalue=2.01×10-8),含有12个基因;其次是戊糖和葡萄糖醛酸转化途径(ko00040)(Qvalue=0.004);参与异喹啉生物碱生物合成、酪氨酸代谢等代谢途径的差异性也比较大。

在氮代谢途径中6个硝酸盐转运蛋白基因、3个亚硝酸盐还原酶基因、2个硝酸还原酶基因和1个谷氨酸脱氢酶基因获得了显著富集(表5)。RNA-Seq结果表明,下调表达基因FPKM比值的log2(fold-change)在-1.06～-1.89,上调表达基因FPKM比值的log2(fold-change)在0.60～1.16。qRT-PCR结果表明,关键基因的表达趋势与测序结果基本一致,下调基因相对表达量比值(FRH1/CRH)为0.29～0.43,上调基因相对表达量比值(FRH1/CRH)为1.56～2.28。基因newGene_31743在2个处理中的相对表达量都比较高,而且CRH处理高于FRH1处理。基因newGene_21354、newGene_24233和newGene_26504的表达量在FRH1处理中高于CRH处理,其余基因表达量在FRH1处理中均低于CRH处理。

表5 氮代谢途径差异基因表达水平

2.6 根系中硝酸还原酶活性、亚硝酸还原酶活性和总氮含量

由图4可知,FRH1处理中烟苗根系硝酸还原酶、亚硝酸还原酶活性分别比CRH显著提高8%和7%,烟苗根系氮含量提高1.7%,但未达到显著差异。

图4 根系硝酸还原酶活性、亚硝酸还原酶活性和总氮含量Fig.4 Nitrate reductase activity, nitrite reductase activity and total nitrogen content of root

3 讨论

稻壳具有改良土壤结构的功能,我国稻壳资源丰富,却未得到充分利用。本研究结果显示,烟草漂浮育苗基质中用发酵稻壳替代炭化稻壳可增加幼苗一级侧根的数量、长度和表面积,提高烟草幼苗株高、根冠比、生长势和壮苗指数,还提高了幼苗根系的CAT和SOD活性,降低了脯氨酸的含量,这与已有研究结果一致[16]。稻壳深施土壤后可以降低土壤容重,提高土壤孔隙度和通透性能,增加土壤有机碳、速效氮、磷、钾等的含量[17-18]。土壤理化性质的改变会影响微生物群落特征[19]。研究还表明,增施稻壳可以提高土壤过氧化氢酶和蔗糖酶活性,对烟草的生长发育有明显的后发效应[20]。

土壤理化性状对烟草碳氮代谢有很重要的影响[21-22],稻壳施入土壤后可以释放氮素。FRH1和CRH处理共有476个显著差异表达基因,其中294个在氮代谢途经得到显著富集。张玉宁等[23]认为,氨基酸、碳氮代谢途径是响应不同氮营养条件的重要代谢途径。在氮代谢途经中挖掘到12个关键基因,其中6个为硝酸盐/亚硝酸盐转运体基因。高等植物有4类硝酸盐转运体家族负责硝酸盐的吸收和转运,除了负责转运硝酸盐外,还负责氨基酸、多肽、硫配糖体、生长素和脱落酸等转运[24]。烟草硝酸盐转运家族基因存在多个成员,目前,主要对NRT1.1、NRT1.2、NRT2.1进行了功能研究[25]。此外,烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT 1.7在非生物胁迫条件下参与硝酸盐的再利用[26];NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运中发挥重要功能[27]。硝酸还原酶是植物氮同化和根系结构重塑的关键酶之一,在一氧化氮稳态中发挥作用[28-29],水稻硝酸还原酶基因OsNR2的等位基因可以提高水稻氮素利用效率和产量[30]。亚硝酸还原酶是一氧化氮介导翻译后修饰的靶标[31],一氧化氮可以通过诱导水稻侧根形成来提高氮吸收能力[32]。此外,12个关键基因中还含有2个硝酸还原酶基因、3个亚硝酸盐还原酶基因和1个谷氨酸脱氢酶基因;与CRH处理相比,FRH1处理中根系硝酸还原酶、亚硝酸还原酶活性和氮含量上升。植物吸收的铵态氮可直接与有机物结合生成氨基酸或者其他含氮化合物,而硝态氮需经硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和谷氨酸脱氢酶的催化作用才能形成含氮化合物[33]。凡聪等[34]研究表明,增施氮肥能提高烟叶硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和蔗糖转化酶活性和总氮含量。综上,笔者认为基质中发酵稻壳的降解,促进了烟草对氮素的吸收、转运和同化,影响了幼苗的氮代谢途径,从而促进烟苗生长。本研究的不足之处是缺少栽培基质中发酵稻壳的降解研究、各氮源转运体如何相互协调发挥作用,以及12个关键基因的功能研究。

4 结论

用发酵稻壳替换漂浮育苗栽培基质中的炭化稻壳后,可以有效改善湘烟7号烟苗生长势,幼苗株高、根冠比和壮苗指数更优,根系脯氨酸含量显著降低,CAT和SOD活性显著升高。294个显著差异表达基因参与了氮代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等20个KEGG代谢通路,并挖掘出参与氮代谢的12个关键基因。FRH1处理中烟苗根系硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性显著高于CRH处理,氮含量无显著差异。