通心络胶囊对自发性高血压大鼠心肌纤维化的干预作用*

罗玮敏，龚彦

1 山东第一医科大学第一附属医院，山东省千佛山医院 山东济南 250014

2 山东省公共卫生临床中心影像中心 山东济南 250102

高血压病是最常见的慢性非传染性疾病[1]。而继发于高血压病的心、脑、血管、肾脏等靶器官损伤，是高血压病患者死亡的主要原因[2]。心肌纤维化是高血压性心脏病最早出现的病理变化，是导致心室重塑与心脏舒缩功能异常的重要环节[3]。但是，临床缺乏有效安全的抗心肌纤维化治疗方法。中医按症状表现可将心肌纤维化归为“胸痹”“心痛”范畴[4]。因心肌纤维化在高血压病缓慢进展的病程中出现，与中医学“久病入络”与“久瘀入络”认识疾病证候演变规律有极大的相似性[5]。通心络胶囊是通络干预的代表方；在本研究中，我们观察了通心络胶囊对自发性高血压大鼠模型心肌纤维化及促纤维化信号通路的影响。

资料与方法

1 材料

1.1 实验动物 40只7周龄体质量180～200 g的雄性SHR大鼠，购自北京维通利华公司（许可证号：SYXK（京）2022-0052）；10只7周龄体质量180～200 g的雄性Wistar大鼠，购济南朋悦实验动物繁育有限公司（许可证号：SCXK（鲁）2019-0003）。实验药物 通心络胶囊（国药准字Z19980015）由河北石家庄以岭药业股份有限公司提供，由人参、水蛭、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片等药物组成。

1.2 实验试剂 Masson三色染色试剂盒购自索莱宝科技有限公司。PCR引物由博尚生物技术有限公司合成。兔抗Smad3、p-Smad3、小鼠抗β-actin购自美国CST公司。兔抗CTGF购自英国Abcam公司。

2 方法

2.1 实验分组 大鼠适应性饲养1周后，将8周龄雄性SHR大鼠（约180～200 g） 共40只随机分为通心络不同剂量治疗组即高剂量治疗组（TXL-H组，10只）、中剂量治疗组（TXL-M组，10只）和低剂量治疗组（TXL-L组，10只）以及阳性对照组（SHR组，10只）。10只8周龄Wistar Kyoto大鼠作为正常对照组（WKY组）。

2.2 给药方法 通心络胶囊内容物溶于生理盐水配成溶液，按通心络高、中、低剂量治疗组，每天分别按每千克体质量给予SHR1.5g、0.75g、0.38g通心络超微粉溶液灌胃。正常对照组（WKY组）和阳性对照组（SHR组）每天给予等量生理盐水灌胃。

2.3 动物取材方法 大鼠20周龄时结束实验。所用大鼠给予腹腔注射0.1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉并处死，过程中尽量减少动物痛苦。用酒精棉球清洁胸部，然后用手术刀在左侧胸部进行侧切，暴露出心脏，使用眼科镊固定和稳定大鼠的心脏。使用注射器在心尖处取血后，在左室心腔中注入生理盐水冲洗，注意以保持心脏的形态和结构。沿着心脏的大动脉和静脉进行切割以便取材。取材后，将心脏放在适当的容器中，用液氮冷冻或用4%多聚甲醛固定其组织结构，为后续实验做准备。

2.4 组织病理学分析 将大鼠心脏标本制备为石蜡切片，进行心肌胶原的Masson染色，观察比较各组大鼠心肌纤维化情况。

2.5 实时定量逆转录PCR 收集各组大鼠的心脏组织并提取总RNA，利用引物进行逆转录和实时定量PCR检测组织中α-SMA和TGFβ1 mRNA的表达水平。

2.6 蛋白印迹 定量称取各组大鼠心脏组织匀浆并提取总蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度。通过电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色等过程，分别检测Smad3、p-Smad3、CTGF等蛋白的表达水平。

3 统计学分析

应用IBM SPSS Statistics 26.0软件分析处理数据，数据以均数±标准差（±s）表示。两组比较采用t检验；组间比较使用单因素方差分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠心肌纤维化病理改变

结果显示，在WKY组中，心肌肌束间有少量的胶原纤维。与WKY组比较，SHR组蓝色区域明显扩大，且心肌肌束间隙变大，在心肌丝田胞间质中可见明显的纤维化改变，且伴有严重的胶原沉积。与SHR组比较，通心络高、中、低剂量组心肌纤维化程度明显减轻，胶原含量减少。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织Masson染色结果

2 各组大鼠心肌组织α-SMA和TGFβ1 mRNA表达的比较

与WKY组比较，SHR组的α-SMA和TGFβ1 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与SHR组比较，通心络高、中、低剂量组α-SMAmRNA表达明显降低（P＜0.05）；而TGFβ1 mRNA表达虽有所降低，但差异无统计学意义。见图2。

图2 心肌组织α-SMA和TGFβ1 mRNA表达的比较

3 各组大鼠心肌组织磷酸化Smad3和CTGF蛋白表达的比较

与WKY组比较，SHR组及通心络高、中、低剂量组的磷酸化Smad3和CTGF蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与SHR组比较，通心络高、中、低剂量组磷酸化Smad3和CTGF蛋白表达明显降低（P＜0.05）。各剂量组间并没有显著差异（P＞0.05）。见图3。

图3 心肌组织磷酸化Smad3和CTGF蛋白表达的比较

讨 论

现代医学研究认为，心肌纤维化是未经良好控制的高血压病在缓慢进展的病程中常见的靶器官损伤表现之一[6]；按其症状表现可归为中医“胸痹”“心痛”的范畴。络病学认为，高血压病的致病因素不能及时消除，病及于心，心络虚滞或郁滞，主持营卫气血交互生化功能障碍，体用俱损，与继发性产生的痰浊、瘀、毒相互影响，络息而成积[7]。通络干预，恢复“络以通为用”，是切合高血压病心肌纤维化病机的治法[8]。通心络胶囊是吴以岭院士创制的通络干预的代表方剂。方中用人参补益心气；用水蛭、土鳖虫、全蝎、蜈蚣、蝉蜕等虫药透络通经、攻毒散结、消癥散积；赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片疏通络气、辛宣止痛。组方体现出“搜、剔、疏、通”的用药规律，共奏益气活血、通络行气、消癥化积之效[9]。

基础研究显示，心肌纤维化导致的细胞外基质累积与胶原纤维增加，是心室重塑和结构破坏的关键环节，进而会引起心脏舒缩功能紊乱甚至心功能失代偿[10-11]。SHR是研究人类原发性高血压时运用最广泛的动物模型，在Pubmed上关于SHR的研究超过24000篇文章。SHR是在Wistar-Kyoto大鼠（WKY）遗传背景基础上挑选的血压自然升高者经数代繁育后形成的稳定的高血压大鼠；因为遗传背景一致，所以WKY大鼠通常作为SHR的正常对照组[12]。与其他高血压动物模型（如肾素转基因大鼠或盐敏感高血压大鼠）比较，SHR与人类原发性高血压具有高度相似的发病机制和缓慢进展的自发性高血压、逐渐加重的靶器官损伤等表现。在SHR心脏可以观察到心肌胶原纤维大量沉积，肌束间间隙明显增加[13]。本实验显示，通心络胶囊显著改善了SHR心肌纤维化。

心肌成纤维细胞主导心肌纤维化的发生与进展[14]。持续高血压引起的神经-体液内环境紊乱，会刺激心肌成纤维细胞表型转化而具有分泌与迁移功能；α-SMA是心肌成纤维细胞转化的主要标志物[15]。本研究显示，自发性高血压大鼠心肌α-SMA表达增加；通心络胶囊抑制了自发性高血压大鼠心肌中的α-SMA表达，提示通心络胶囊减少了心肌成纤维细胞的转化。

在心肌成纤维细胞转化相关的信号通路中，Smad3被认为是是与高血压相关的心脏纤维化和心肌成纤维细胞转化密切相关的关键分子[16]。磷酸化Smad3蛋白由细胞浆转位至细胞核内，对众多与促进了与心肌成纤维细胞表型转化和促纤维形成相关的细胞事件相关的靶基因表达[17-18]。本研究显示，自发性高血压大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平增加；通心络胶囊抑制了自发性高血压大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平。有研究显示，Smad3的磷酸化存在TGFβ1依赖性与非依赖性两条不同的促纤维化信号通路[19]。本实验显示，自发性高血压大鼠心肌组织TGFβ1水平升高；但是，通心络胶囊未改变自发性高血压大鼠心肌组织TGFβ1水平，提示通心络抗心肌纤维化作用可能与TGFβ1无关。CTGF既是Smad3调控的下游靶基因，且具有广泛的促纤维化作用[20]。自发性高血压大鼠心肌CTGF表达水平升高；通心络胶囊抑制了自发性高血压大鼠心肌中CTGF表达。

综上所述，通心络胶囊通过抑制非TGFβ1依赖性Smad3/CTGF促纤维化通路，减少了心肌成纤维细胞主导的心肌纤维化；因此，通络干预，恢复“络以通为用”，切合高血压病心肌纤维化病机，可以作为治疗高血压病心肌纤维化的基础治疗；亦提示在临床治疗中随证化裁合理运用通络干预法，将有助于提高高血压病心肌纤维化的治疗效果。