“山茱萸—菟丝子”治疗慢性肾小球肾炎作用机制探讨*

孟令裕，王圣治

1 辽宁中医药大学 辽宁沈阳 110847

2 辽宁中医药大学附属医院 辽宁沈阳 110032

慢性肾小球肾炎（ chronic glomerulonephritis，CGN），以蛋白尿（0.3～3.4g/d）、血尿、高血压和水肿为基本临床表现，常见于多种病理类型，发生于任何年龄，但以中青年为主，男性多见。多数起病缓慢、隐匿。早期病人可有倦怠乏力、腰部疼痛和食欲缺乏，伴或不伴有轻度浮肿，实验室检查多为轻度尿异常，肾功能正常或轻度受损这种情况可持续数年，甚至数十年，肾功能逐渐恶化，最后进入终末期肾衰竭，是我国终末期肾衰的首要病因。CGN的治疗以防止或延缓肾功能进行性恶化、改善或缓解临床症状及防治心脑血管并发为主要目的。目前CGN的治疗主要包括积极控制高血压和减少尿蛋白；限制食物中蛋白及磷的入量；糖皮质激素和细胞毒药物以及避免加重肾脏损害的因素。2021年KDIGO指南[1]指出减少蛋白尿对控制肾小球原发疾病、减少肾小球高灌注、减轻足细胞损伤、肾小球瘢痕形成、减少血清白蛋白流失进而降低血栓栓塞和感染的风险以及减轻患者症状和代谢并发症从而提高生活质量都有至关重要的作用。其中以肾素-血管紧张素抑制剂（renin-angiotensinsystem inhibitors RASI）为首选药物，尿蛋白较多的患者可考虑糖皮质激素和细胞毒药物。

CGN为现代医学所定义的疾病，中医对CGN没有确切的病名，但从临床表现和病位关系来看，CGN与中医学中的“肾风”“风水”“虚劳”“水肿”“腰痛”等疾病中的某些证型无论是病因病机还是证候都极为相似。本病病因病机以肺，脾，肾虚为本；以风、寒、湿、热、浊毒、瘀血交阻肾络为标。可见正虚邪恋是该病发病的核心环节，因此，中医在治疗上，应坚持“治本”与“治标”并重。尤其在缓解蛋白尿方面，近年来有大量研究证实，RASI联合中医自拟方或中成药其减轻蛋白尿、保护肾脏的疗效明显高于单纯RASI治疗[2-3]。蛋白质是构成细胞乃至整个人体的物质基础，这与中医所说的“精”相对应，属于人体内精微物质，因此蛋白尿所对应的中医概念是“精气外泄”，当治以开源节流。一方面补充精气，肾虚是发为本病的基础，而从五行相生理论来看，肾属水，肝属木，水能生木，肝为肾之子，从位置上，肝肾同属下焦，乙癸同源，经脉相通，故补子而壮母；肾病日久，精气外泄，精血亏虚，而在生理功能上肾藏精，肝藏血，肝肾同源，精血同源，故补肝肾以益精养血。另一方面固摄精气减少流失。因此选择既能补肝肾又能固精的药物成为治疗CGN的关键，山茱萸：味酸、涩，性微温，归肝、肾经、主入肝，补益肝肾，收涩固脱；菟丝子：味辛、甘，性平，归肝、肾、脾经，补益肝肾，固精缩尿。在郭恩绵[4]教授治疗CGN的用药规律中，得出山茱萸-菟丝子这一药对，为这一理论提供了有力的事实根据，然而，关于山茱萸-菟丝子这一药对减少蛋白尿作用机制尚不明确。网络药理学是一种基于生物网络的药物-靶点-疾病关联分析的新技术，通过构建“多基因-多靶点-多通路”交互网络，实现药物作用机理的可视化[5-6]。因此，本研究拟采用网络药理学等方法，寻找“山茱萸-菟丝子”对治疗CGN的作用靶点，并从整体、细胞和分子水平阐明“山茱萸-菟丝子”对改善 CGN蛋白尿的干预机制，以期为临床应用提供新思路。

资料与方法

1 山茱萸-菟丝子药对有效活性成分的筛选和靶点预测

采用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（网址：https：//www.tcmsp-e.com/）分别对山茱萸和菟丝子中的全部化学成分进行检索（以口服生物利用度（oral bioavai-lability，OB）≥30%并且类药性指数（drug like index，DL）≥0.18为筛选条件），得到山茱萸和菟丝子中的有效活性成分和相应的基因靶点，并通过 Uniprot数据库（网址：https：//www.uniprot.org/）对相应的基因名称标准化（检索时设定筛选条件：基因来源物种为“Human”）[7]。

2 CGN疾病靶点预测

在 GeneCards的数据库（网址：https：//genealacart.genecards.org/）中，输入“Chronic Glomerulonephritis”作为关键字，收集与CGN相关的基因靶点。通过Venny2.1.0（网址：https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到山茱萸-菟丝子-CGN三者交集靶点，即山茱萸-菟丝子药对治疗CGN的潜在靶点。

3 山茱萸菟丝子药对-CGN成分靶点-靶点网络构建

利用Cytoscape3.9.1构建中药有效成分-交集靶点网络图。

4 蛋白质互相作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络分析及核心靶点预测

将1.2中得到的山茱萸-菟丝子-CGN三者交集靶点导入到STRING数据库（网址：https：//cn.stringdb.org/），以基因来源为“homo sapiens”并且中等置信度数值为0.4为条件去除不符合标准的靶点，获得了PPI网络，并将其以 TSV格式存储起来。将此文件导入到Cytoscape3.9.1中构建可视化PPI网络图，在此基础上，利用 MCODE插件对PPI网络进一步筛选。

5 基因富集分析

将1.2中得到的山茱萸-菟丝子-CGN三者交集靶点入到 Metascape数据库（网址：http：//metascape.org/）中，进行GO与KEGG通路富集分析[8-14]。以P＜0.05为筛选条件对山茱萸-菟丝子药对对CGN的作用机制进行分析，并将其结果在微生信网络平台（网址：http：//www.bioinformatics.com.cn/）上进行可视化分析。

6 “成分-靶点-通路”网络构建

从1.5筛选出的KEGG通路中以P的数值大小为条件，筛选出排名前20的通路，通过Cytoscape 3.9.1构建山茱萸-菟丝子治疗CGN的“成分-靶点-通路”网络图。

结 果

1 山茱萸-菟丝子药对有效成分及靶点筛选

从 TCMSP数据库中得到了226个山茱萸成分和29个菟丝子成分。再通过ADME参数筛选并且删去重复值之后，得到了30个活性成分，其中20个来自山茱萸，11个来自菟丝子，β-谷甾醇（beta-sitosterol）是二者共有的成分。

山茱萸萸-菟丝子药对的组成在表1中有说明；在此基础上，以TCMSP为基础，进行了相应的筛选，最终得到了235个药物潜在靶点。

表1 山茱萸-菟丝子药对部分成分信息

2 活性成分-交集靶点网络构建

通过在GeneCards数据库中检索关键字“Chronicglomerulonephritis”，我们发现CGN有1874个潜在靶点。利用在Venny2.1.0网站上获得的27个药物-疾病交集靶点，见图1。基于药物-疾病交集靶点，从TCMSP数据库中筛选山茱萸-菟丝子药对对应的活性成分，采用 Cytoscape3.9.1构建山茱萸-菟丝子药对活性成分与药物-疾病交集靶点所构成的成分-靶点网络图。见图2。

图1 药物-疾病交集靶点

图2 成分-靶点网络图

3 PPI网络及关键成分、靶点分析

将Venny2.1.0中得到的27个药物-疾病交集靶点导入 STRING数据库，得到一个包含22个节点和64条边的PPI网络图。将相应的 PPI网络图从 STRING数据库中以TSV格式下载，然后导入Cytoscape3.9.1中，获得 PPI网络图，如图3所示。利用 MCODE插件对其进行集群分析，获得了 AR，BAX，CASP3，JUN，NOS2，PPARG，PRKCA，PTGS2，TGFB1，9个核心靶点，并得到核心靶点网络图，见图4。并找到核心靶点所对应的药对活性成分包括槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦参碱、豆甾醇、甘露醇、羟基芫花素、四氢鸭脚木碱，并用Cytoscape3.9.1构建核心成分-核心靶点网络图，见图5。

图3 PPI网络

图4 核心靶点网络图

图5 核心成分-核心靶点网络图

4 GO与KEGG通路富集分析

在Metascape数据库中导入27个山茱萸-菟丝子药对治疗CG的潜在靶点，以P＜0.01为筛选条件，在（Gene Ontolog，GO）数据库中获得细胞组分（cellular component，CC）24条、生物过程（biological process，BP）394条、分子功能（molecular function，MF）38条，以-LogP为筛选条件从大到小排序，各选取前10条信息绘图，见图6。以P＜0.01为筛选条件，在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库中获得信号通路82条以-LogP为筛选条件从大到小排序，选取前20条通路绘图，见图7。

图7 KEGG信号通路分析

5 “成分-靶点-通路”网络构建

通过Cytoscape3.9.1构建“信号通路-靶点-活性成分”网络图，见图8。其中度值最高的3个成分为槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚；度值前8的靶点：CASP3、BAX、BCL2、CASP8、JUN、 PRKCA、 NOS2、TGFB1。

图8 成分-靶点-通路网络图

讨 论

现阶段临床对于CGN的治疗可概括为两方面。一方面是依据肾活检病理结果予免疫抑制治疗，抑制免疫反应对肾小球的损伤，长期用药不良反应较多，如骨质疏松、肥胖、股骨头坏死等；另一方面是针对以蛋白尿、血尿、高血压和水肿为临床表现的肾炎综合征的对症治疗，最佳治疗策略尚不清楚。中医对CGN的治疗以证为辨证要点，认为CGN蛋白尿关键在于肾虚失于封藏，阴精外泄。治法上应采取平补肝肾，固摄阴精的基本治疗原则以治本。方选滋肾露，山茱萸：味酸、涩，性微温，归肝、肾经、主入肝，补益肝肾，收涩固脱，为君药；菟丝子：味辛、甘，性平，归肝、肾、脾经，补益肝肾，固精缩尿，为臣药。两者乃平补肝肾，固精止遗之药要。山茱萸与菟丝子两药君臣相伍，补阳固精与滋阴益精并施，药味虽少但功效显著，阴阳同调，既补充肾精又减少肾精流失，以达到固肾填精的作用。

细胞及动物相关实验研究已证实山茱萸、菟丝子中的活性成分，如山茱萸多糖、菟丝子多酚等具有抗氧化、免疫调节、抑制免疫因子释放、降低炎症水平、抑制细胞凋亡作用。丁国明等[15]用胃嘌呤溶液灌胃制备慢性肾功能衰竭大鼠模型，证实山茱萸提取物通过下调慢性肾衰竭大鼠的炎症因子包括TNF-α、IL-6 水平；通过降低慢肾衰大鼠体内织 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、NOX1、活性氧（ROS）及 p-细胞外信号调节激酶（p-ERK）的水平抑制 对氧化酶（oxidase）/ROS/ERK信号通路在慢性肾衰竭中诱导凋亡的水平，进而抑制肾脏的纤维化，起到肾脏保护的作用。菟丝子中的槲皮素可通过上 调Bcl-2和下调Bax的表达，抑制肾损伤小鼠肾脏细胞凋亡，并降低炎性因子IL-1β和IL-6的释放，发挥其对LPS诱导小鼠急性肾损伤的保护作用；石柳柳等研究发现槲皮素可降低炎性因子IL-1β和IL-6的释放，通过上调Bcl-2和下调Bax的表达[16]。

以上研究利用TCMSP数据库、Venny2.1.0网站等网络药理学研究工具，筛选出30个山茱萸-菟丝子药对活性成分，235个药物潜在靶点，27个与CGN的疾病靶点取交集后得到的交集靶点。交集靶点在Cytoscape3.9.1中的MCODE插件筛选出9个核心靶点，包括AR、BAX、CASP3、JUN、NOS2、PPARG、PRKCA、PTGS2、TGFB1，并找到核心靶点所对应的药对活性成分包括槲皮素、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、芝麻素、苦参碱、豆甾醇、甘露醇、羟基芫花素、四氢鸭脚木碱。β-谷甾醇是一种植物甾醇，与胆固醇结构相似，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗肿瘤等作用[17]，对肾脏有保护作用。有研究发现β-谷甾醇可通过激活NRF-2的抗氧化酶调节活性保护肾毒性小鼠模型的肾脏功能，并清除其体内产生的过量过氧化物和有毒物质[18]。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物[19]，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、控制血糖、免疫调节等作用[20]。有研究表明槲皮素可抑制2型糖尿病大鼠的肾脏肥大[21]；通过调节氧化应激和INOs（诱导型一氧化氮合酶）/p38MAPK 信号通路，缓解腺嘌呤诱导的慢性肾衰大鼠模型血管钙化；调节辅助T细胞水平 即提高Th1细胞比例，减少TH2细胞比例，增强系统性红斑狼疮小鼠细胞免疫功能，起到保护肾功能的作用[22]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌、降胆固醇、保护神经、镇痛、抗糖尿病等作用，在治疗糖尿病、骨关节炎、黑色素瘤等疾病中的作用机制得到部分验证[23]，但其在CGN中的作用尚未得到证实。

GO分析中BP注释表明山茱萸-菟丝子药对可能通过参与血液循环、细胞对有机环化合物的反应、磷酸化的正向调控等生物过程作用于CGN；CC注释表明山茱萸-菟丝子药对可能通过参与血液微粒、膜筏、膜微域、丝氨酸型内肽酶复合物、丝氨酸型肽酶复合物等细胞组分调控上述过程。

KEGG pathway富集分析显示山茱萸-菟丝子活性成分治疗CGN的靶点主要富集在IL-17 信号通路、钙信号通路、细胞凋亡、p53 信号通路，在生理条件下，p53是一种通过抑制细胞分裂，促进细胞衰老甚至凋亡，抑制异常细胞增殖的因子，参与到细胞周期的调控中。有研究表明肾脏病理中，肾脏组织中细胞周期蛋白P53阳性率越高，蛋白尿、高血压的严重程度就越高，对肾功能的损害也越大[24]。

白介素-17（interleukin-17，IL-17）是一个重要的促炎症细胞因子，是由CD4+T淋巴细胞中除辅助T细胞1（Th1）和辅助T细胞2（Th2）亚群以外的第三亚群——辅助T细胞17（Th17）分泌的特征性细胞因子[25]，包含6个结构相关的细胞因子，即IL-17A到IL-17F，其中以IL-17A最为多见[26]。在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用，多方面研究证实CGN发病与 CD+4T细胞 Th1/Th2细胞平衡紊乱、Th17功能改变密切相关[27-32]。其在肾小球肾炎中的作用也得到越来越多的证实[33]。有动物研究证实，抗肾小球基底膜肾小球肾炎的动物肾的Th17占活化T细胞的比率升高[34]；又临床研究指出，抗中性粒细胞胞浆抗体 （antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相关性血管炎患者的血清IL-17A水平及髓过氧化物酶（myeloperocidase，MPO）和PR3特异性的Th17数均增高[35-36]。可见IL-17的异常增高与自身免疫相关肾小球肾炎的发生有着密切的联系。 Huh JR等，用IL-17A 缺陷的小鼠制成的抗MPO肾小球肾炎模型证实了 IL-17A的作用。IL-17A缺陷的小鼠肾病变轻，IL- 17A能促进中性粒细胞向肾小球聚集，提高对MPO的获得性自身免疫[37]。有力的证实了IL-17A确实是介导自身免疫性肾炎的关键因素。由此可推测抑制Th17细胞的分化、减少IL-17的分泌，研发IL-17A或IL-17R的抗体可成为治疗CGN的新思路。

综上，本文基于网络药理学技术深入挖掘得到“山茱萸萸-菟丝子”治疗 CGN的药物有效成分、其对CGN的潜在作用靶点以及药物可能发生作用的分子通路，这为揭示中药治疗CGN多靶点-多通路的复杂作用机理提供了理论依据，未来可对其中的关键成分和核心靶点进行体内和体外实验验证。