牛膝-菟丝子药对防治高血压肾损伤网络药理学机制研究*

徐瑾，张文婷，王时光

1 安徽中医药大学第一临床医学院 安徽合肥 230012

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

原发性高血压是临床上常见的疾病，其患病率及绝对负担在全球范围内正在上升[1]。以持续性的血压升高为主要病理改变，且随着疾病进展，对肾脏的功能有较大影响出现病理性改变，称为高血压肾损伤。高血压肾损伤也会反馈性升高血压水平，形成恶性循环。对于高血压肾损伤的治疗主要是用降血压药物治疗使血压控制在正常范围以减少肾脏损害。中医药在分子水平上具有多靶点、多途径的作用，中西药联合可能在控制血压的同时保护肾脏，改善远期预后。

《本草备要》中有提到菟丝子能够：“补三阴，入足三阴（脾、肝、肾），强阴益精”。具有祛风明目，补益肝肾，助筋脉等功效。《名医别录》中记载怀牛膝能够：“疗伤中少气，填骨髓，益精，利阴气，止发白”。具有补肝肾，强筋骨，引血下行等功效。网络药理学通过构建生物系统网络，分析活性成分、蛋白靶点、信号通路之间的生物学联系，可以在分子水平上多成分、多靶点地分析中药治疗疾病的作用机制，为怀牛膝-菟丝子治疗高血压肾损伤寻找新的作用靶点提供理论依据，以及对实验验证及药理研究奠定基础。

资料与方法

1 活性成分及靶点的筛选

以“怀牛膝”“菟丝子”为关键词，在中药系统药理数据库分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中检索，筛选数据，筛选条件为：口服生物利用度（OB） ≥ 30%，类药性质（DL）≥ 0.18。使用TCMSP数据库筛选与活性化合物相关的靶点，在UniProt （http：//www.uniprot.org/）数据库中将上述得到的靶点基因名称匹配对应“人”的靶点基因，去除重复基因，收集重叠的靶基因和活性化合物，即可获得所需的活性成分靶点，将活性成分输入数据库，检索获得对应的靶蛋白。利用Cytoscape3.9.1软件建立网络图。

2 疾病候选靶点的筛选

在Gene Cards数据库（http：//www.genecards.org/）中以“Hypertension renal damage ”为关键词，获取高血压肾损伤相关基因，设定相关性分值设置为＞10，筛选出符合条件的基因，在Omim数据库（https：//www.omim.org）中输入关键词“Hypertension renal damage”，符合条件的基因，将两个数据库获得的基因整合在一起去除重复项获得疾病候选靶点。采过Venny工具获取菟丝子、怀牛膝活性成分靶点与高血压肾损伤的基因靶点交集的基因，即潜在靶点。

3 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

将潜在靶点输入至STRING数据库（https：//string-db.org/），以物种为“人”作为筛选条件，设置所需的最低交互分数最高置信度为0.9，筛选过后的PPI网络图以TSV格式下载，通过Cytoscape3.9.1软件对TSV格式的文件内容进行可视化展示，即可获得PPI网络图与关键核心靶点。

4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape数据库进行自定义分析，选择物种参数为“人”，将所得富集条目按照P值由小到大顺序排列，选择Top10通路输入微生信云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn），进行可视化处理。通过GO功能富集分析：生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF），同时进行KEGG通路富集分析，对药物作用靶点或差异表达基因进行信号通路分析。

结 果

1 活性成分的获取

以1.1中的设置条件为筛选条件，在TCMSP、Uniprot数据库中得到怀牛膝-菟丝子相应活性成分的待选靶基因共206个，得到24种有效活性成分（表1）。将药物、活性成分、靶点基因导入Cytoscape3.9.1中构建药理学网络图（图1）。根据网络数据分析可以得出槲皮素所对应的靶点最多为134个，其次是山柰酚为53个，再次是黄芩素、β-谷甾醇等，这些活性成分在怀牛膝—菟丝子药对治疗疾病中可能发挥重要作用。

图1 怀牛膝、菟丝子药物成分-靶点网络

表1 怀牛膝、菟丝子活性成分信息

2 高血压肾损伤靶点

用1.2项下的方法共检索到高血压肾损伤相关靶点1762个。将1762个高血压肾损伤靶点与怀牛膝-菟丝子药对的206个靶点基因做韦恩图（见图2），获得113个交集基因，以此作为怀牛膝-菟丝子药对治疗高血压肾损伤的预测靶基因。

图2 怀牛膝、菟丝子与高血压肾损伤靶点交集韦恩图

3 PPI网络的构建

PPI网络分析可以更有效地、直观地从系统的角度获取药物的靶蛋白基因，如图3所示。利用Cytoscape画图软件构建的PPI网络图由113个节点组成。将2.2中得到的113个交集靶点输入到STRING数据库中，下载TSV格式的结果文件，并将其导入Cytoscape3.9.1中构建PPI网络图（见图3），图中的靶蛋白的节点大小随着degree值的增大而增大，颜色也随着节点变大而逐渐加深，反映一个蛋白与蛋白互作关系的蛋白有多少度越大，这个点越容易影响其他蛋白，中药程度有可能越高。图中线越粗颜色越红越大，中药程度越强，表明得分越高。如肿瘤抑制蛋白P53（TP53）、蛋白激酶B1（AKT1）、原癌基因（RELA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、肿瘤坏死因子（TNF）、丝裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、白细胞介素6（IL-6）等。

图3 怀牛膝、菟丝子与高血压肾损伤核心交集靶点的PPI网络

4 GO生物功能及KEGG通路富集分析

利用Metascape数据库，选择物种为“人”，进行GO分析和KEGG通路富集分析（见图4、图5），其中GO分析共包含：生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能分析（MF），其中BP分析表明相关靶点主要与对无机物的反应、对氧化应激的反应、对化学应激的细胞反应等功能有关；CC分析表明有关靶点主要与膜筏、膜微域、转录调控复合物功能有关；而MF分析结果则表明，这些靶点与癌症中的通路、免疫系统的细胞因子、白细胞介素功能密切相关。KEGG通路富集分析结果癌症中的通路、脂质和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等信号通路，均与高血压肾损伤的发生发展关系密切。

图4 怀牛膝、菟丝子治疗高血压肾损伤的GO功能分析

图5 怀牛膝、菟丝子治疗高血压肾损伤的KEGG富集分析

讨 论

高血压肾损伤病位在肝肾，临床上最常见的中医证候分型为阴虚阳亢证，患者肝肾阴虚，阴不敛阳，肝阳上亢，肾虚固摄不利，发为本证。怀牛膝和菟丝子为补益肝肾代表药物。怀牛膝在现代药理学中具有抗炎、降压、降脂、降糖、提高免疫力等作用，菟丝子具有提高免疫功能、改善心肌缺血、促进造血等作用。

本研究通过网络药理学分析得知，怀牛膝-菟丝子中槲皮素、山柰酚、黄芩素、β-谷甾醇是与靶点蛋白发生作用的前四位。槲皮素、山柰酚属于黄酮醇类化合物，槲皮素对血管内皮细胞具有抗细胞凋亡和抗炎作用，能够阻断核因子-κB（NF-κB）和AP-1信号通路来抑制TNF-α诱导的细胞凋亡和炎症[2]。槲皮素可诱导巨噬细胞M2极化，抑制炎症反应[3]，槲皮素还可以通过SIRT1/PINK1/线粒体自噬轴减少肾小管上皮细胞衰老来缓解肾纤维化[4]，山柰酚具有保护血管形态和降低血脂，抑制炎症和细胞凋亡[5]。有研究表明还可以抑制肾脏细胞上皮-间充质转化过程，保护肾脏纤维化，改善肾功能[6]。黄芩素和β-谷甾醇都具有保护血管内皮细胞的作用。黄芩苷在体外防止氧化应激引起的血管内皮功能障碍和内皮细胞损伤，并通过抗氧化防止体内动脉粥样硬化[7]。还可以减轻心脏氧化应激、炎症和细胞凋亡[8]。β-谷甾醇能够干扰多种细胞信号通路，包括细胞周期、细胞凋亡、增殖、血管生成、抗炎、抗氧化、心脏保护等作用[9]。研究表明下调了肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的水平，并上调了内皮一氧化氮合酶的水平。β-谷甾醇对肾脏和心脏坏死和细胞凋亡的具有治疗潜力[10]。

PPI网络分析发现，TP53、AKT1、RELA、MAPK1、TNF、MAPK14、IL6等是怀牛膝-菟丝子药对治疗高血压肾损伤的主要作用靶点。在人的基因里面，TP53是非常重要的抑癌基因，TP53基因翻译的P53蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。研究表明TP53参与再狭窄和动脉粥样硬化，血管平滑肌细胞生长和细胞死亡的发展。血管炎症被认为参与多种心血管疾病的血管重塑，包括动脉粥样硬化和高血压[11]，且TP53可通过miR-31a-5p途径作用于动脉平滑肌细胞凋亡参与高血压的发病机制[12]。AKT1通过抑制细胞凋亡过程参与细胞存活途径，可以阻止细胞凋亡从而促进细胞存活。AKT可以增加血管内皮生长因子的分泌。还调节其他血管生成因子（如一氧化氮和血管生成素）的表达[13]。 RelA是构成NF-κB转录因子家族的五种成分之一。介导新血管生成的相关蛋白的基因受NF-κB的调节。其中就有血管生成因子家族中最重要的成员——血管内皮细胞生长因子（VEGF），持续性激活的NF-κB能增强VEGF基因的转录。NF-κB通路主要介导炎症反应，在缺氧上皮细胞中被激活，并通过调节其靶炎性细胞因子、粘附分子和促炎酶促进肾组织的纤维化[14]。MAPK1是丝裂原活化蛋白激酶MAPK信号途径是重要的信息传递链，是细胞增殖、应激、炎症、分化、功能同步化、转化、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，把胞外信号经信号网络，传递到胞内，参与细胞增殖、分化、癌变、转移、凋亡等，不同的生长刺激、应激刺激，在不同的细胞.经不同细胞骨架局限的不同信号通路，可产生多种效应。其中细胞外信号调节激酶（ERK）属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，其级联受RAF蛋白MEK1/2和ERK1/2的控制。ERK2缺乏来改变ERK信号通路可以减少肝纤维化和炎症反应[15]。Sirtuin 6（SIRT6）是一种NAD依赖性脱乙酰酶，与健康和生理学的许多方面有关。研究发现SIRT6与ERK1和ERK2的启动子结合能够抑制ERK1 / 2表达。此外，抑制ERK1/2活性消除了SIRT6敲除引起的肾损伤加重[16]。

怀牛膝-菟丝子治疗高血压肾损伤的靶点KEGG通路富集结果显示，癌症的途径、AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子、IL-17信号通路等为与高血压肾损伤治疗相关度较高的主要通路。AGE-RAGE信号通路是一种重要的炎症信号通路，它参与了多种疾病的发生和发展，包括糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病。晚期糖基化终产物（AGE）及其细胞受体（RAGE）和可溶性受体（sRAGE）在老年人群高血压的进展中有重要的作用，血清中的AGE水平与动脉硬度以及高血压呈正相关。血清 sRAGE水平低与动脉硬化和高血压有关。sRAGE的水平与年龄和血压呈负相关。AGE-RAGE介导的心血管疾病可以通过AGEs消耗量的减少，RAGE的抑制和sRAGE的升高而减弱[17]。AGEs-RAGE轴激活诱导肾小球纤维化、肾小球基底膜增厚及细胞外基质增加等病理损伤，Jiajun Chen等发现抑制AGE/RAGE轴可以抑制相关的下游炎症分子和粘附分子，减轻炎症反应、保护肾脏[18]。TNF是由巨噬细胞分泌，能够导致血管功能紊乱或损伤内皮细胞，使血管损伤。其中TNF-α与炎症的关系极为密切。有关研究发现TNF-α能刺激肾小球系膜细胞产生氧自由基，会导致血管紧张素II诱导的血压升高和肾小球损伤[19]。IL-17是促进炎症的因子，与肿瘤坏死因子和白介素-1协同作用，在免疫反应中发挥重要作用，在高血压患者中，血清IL-17水平显著高于健康人。同样，长期输注血管紧张素II刺激IL-17的产生，并增加血管壁内IL-17的表达，能够使高血压患者的血压升高和肾脏炎症[20]。

综上所述，怀牛膝-菟丝子可能通过调节多种途径抑制炎症反应，在高血压肾损伤的治疗中发挥抗炎作用。但本研究基于网络药理学对药物和疾病进行理论分析，仍需要进一步的临床实验和实验室研究对其进行验证。