PI3K抑制剂林普利塞对弥漫大B细胞淋巴瘤的体外抗肿瘤效应

张凯敏 黄玉洁 段莹 郭宝平 柯晴 廖成成 岑洪

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院淋巴血液及儿童肿瘤科

弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是成人中最常见的一种侵袭性B 细胞淋巴瘤，可分为生发中心B细胞（germinal center B-cell like，GCB）亚型和活化B细胞（activated B-cell like，ABC）亚型［1］。B 细胞的AKT（也称为蛋白激酶B）对生发中心的形成和维持、抗体的产生和亲和力的成熟必不可少［2-3］。PI3K（phosphatidylinositol 3 kinase）家族由一系列丝氨酸/苏氨酸和脂质激酶组成，其可启动AKT的激活［4-7］。另外，研究发现PI3K 信号通路在控制B细胞生长、增殖和代谢中起着重要作用［8］。PI3Kδ 是PI3K 的一个亚型，研究证实PI3Kδ 在维持B 细胞功能及与B 细胞有关的肿瘤发生中发挥作用［9］。由于PI3Kδ 参与B 细胞受体（B cell receptor，BCR）信号传导，并在B 细胞存活和分化中发挥重要作用，因此PI3K 有可能成为DLBCL 的治疗靶点。林普利塞（Linperlisib，YY-20394）是由上海璎黎药业有限公司自主研发的一种PI3Kδ选择性抑制剂，对滤泡中心起源的B 细胞淋巴瘤（滤泡淋巴瘤）患者表现出较好的疗效［10］，但在GCB 亚型和ABC 亚型DLBCL 中的作用机制尚未明确。本研究拟探索YY-20394 对SU-DHL-4 细胞（属于GCB 亚型）和U2932 细胞（属于ABC 亚型）的抗肿瘤效应及其在不同亚型DLBCL 细胞中的作用机制，为PI3K 抑制剂治疗DLBCL 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

SU-DHL-4 细胞（GCB 亚型人DLBCL 细胞株）和U2932 细胞（ABC 亚型人DLBCL 细胞株）均购自南京科佰生物科技有限公司。PI3K 抑制剂YY-20394（纯度＞99%）由上海璎黎药业有限公司赠送；RPMI-1640培养液及胎牛血清均购自美国Gibco 公司；PE Annexin V 凋亡试剂盒购自美国BD Biosciences 公司；青霉素和链霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；总RNA 提取试剂盒购自苏州新赛美生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

将SU-DHL-4细胞和U2932细胞于含10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素及100 µg/mL 链霉素的RPMI-1640培养液中悬浮生长，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞密度达到80%～90%时，进行消化传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 CCK-8法检测药物对细胞增殖的影响

取对数生长期的SU-DHL-4 细胞和U2932 细胞，用完全培养基稀释成5×105个/mL 的细胞悬液，按90 µL/孔接种于96 孔板中，再加入10 µL 已用DMSO溶解的不同浓度的YY-20394 药液，使其终浓度为0.875、1.750、3.500、7.000、14.000 µmol/L，同组样本设置3 个重复孔。分别于培养24 h和48 h后，向每孔加入10µL CCK-8 试剂，继续培养4 h，使用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔吸光度（A）。细胞增殖抑制率=［（Ac-As）/（Ac-Ab）］×100%。Ab：空白孔（不含细胞和药物的完全培养基，含有CCK-8）；Ac：对照孔（含有细胞的完全培养基、CCK-8、溶解药物所需的等量DMSO，无药物）；As：实验孔（含有细胞的完全培养基、CCK-8 和药物）。使用GraphPad Prism 5.0 软件分别计算YY-20394的25%抑制浓度（25% inhibitory concentration，IC25）、50%抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）、75% 抑制浓度（75% inhibitory concentration，IC75）。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

取对数生长期的SU-DHL-4 细胞和U2932 细胞，调整细胞密度至5×105个/mL 后接种1 mL 于6 孔板中，根据YY-20394 的IC25、IC50、IC75，加入相应浓度的YY-20394药液，孵育24 h后，按照PE Annexin V 凋亡试剂盒说明书，用PBS 液清洗细胞2 次，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。取100 µL 的细胞悬液于5 mL 流式管中，先加入5 µL PE Annexin V 染料，混匀后于室温避光孵育5 min，再加入5 µL 7-AAD 染料。最后加入400 µL 1×Binding Buffer，1 h 内使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算凋亡率。

1.5 转录组高通量测序

取各组对数生长期的SU-DHL-4细胞和U2932细胞，调整细胞密度为5×105个/mL接种1 mL于6孔板中，根据YY-20394的IC50，加入相应浓度的药液孵育24 h，各组样本设置3 个重复孔。培养24 h 后离心收集细胞。PBS 漂洗2 次后用Trizol 试剂裂解细胞。按照总RNA 提取试剂盒说明书对样本进行RNA 抽提。由深圳中科普瑞生物技术有限公司进行RNA-Seq测序。

1.6 生物信息学分析

采用R 4.0.1 软件limma 包分析药物处理前后SU-DHL-4 细胞和U2932 细胞转录组表达谱基因的表达变化，并将分析结果可视化，绘制火山图和热图；利用R 软件clusterProfiler 包对差异表达基因进行KEGG富集分析和GO 功能注释分析，进一步探索基因功能及其细胞定位、生物学功能；并且利用GSEA 富集分析药物处理前后各细胞表达的基因在常见肿瘤相关信号通路的富集情况，探讨药物的作用机制。

1.7 统计学方法

实验数据采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，正态分布数据采用均数±标准差表示，两组样本比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不满足正态分布的数据，采用中位数（四分位数间距）表示，非参数检验进行组间比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 YY-20394抑制DLBCL细胞的增殖能力

CCK-8结果（图1A）显示，不同浓度（0.875、1.750、3.500、7.000、14.000 µmol/L）的YY-20394 处理SU-DHL-4 细胞24 h 后，均对细胞增殖能力表现出抑制作用，且随着浓度的增加而逐渐增加，其中YY-20394 的IC25为（0.69±0.71）µmol/L、IC50为（3.30±0.46）µmol/L、IC75为（15.79±2.31）µmol/L；在不同浓度YY-20394 处理48 h 后也观察到类似的效应，提示YY-20394 能抑制SU-DHL-4 细胞生长，其效应随着药物浓度的增加和时间的延长而增强。YY-20394 处理U2932 细胞24 h 和48 h 后，细胞增殖能力未被明显抑制（图1B）。基于此，选择YY-20394 药物处理24 h 后SU-DHL-4细胞的IC25（0.69µmol/L）、IC50（3.30µmol/L）、IC75（15.79µmol/L）用于后续的细胞凋亡实验，进一步探索药物对该细胞株的凋亡诱导作用。

图1 YY-20394对SU-DHL-4和U2932细胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of YY-20394 on proliferation of SU-DHL-4 and U2932 cells

2.2 YY-20394诱导SU-DHL-4细胞凋亡

流式细胞术结果如图2 所示，不同浓度（0.69、3.30、15.79 µmol/L）YY-20394 分别处理SU-DHL-4 和U2932细胞24 h后，SU-DHL-4细胞中3个药物浓度组细胞的凋亡率均较未处理组增加［（6.87±0.37）%、（14.95±0.25）%、（40.58±0.52）%vs（5.32±0.32）%，均P＜0.05］；U2932 细胞中3个药物浓度组细胞的凋亡率与未处理组比较差异均无统计学意义［（4.42±0.15）%、（4.31±0.22）%、（4.32±0.14）%vs（4.28±0.22）%，均P＞0.05］。上述结果表明，YY-20394 对SU-DHL-4 细胞凋亡有一定影响，且对细胞凋亡的影响随药物浓度的递增而增大，但对U2932细胞凋亡没有明显影响。

图2 流式细胞术检测YY-20394作用后SU-DHL-4和U2932细胞的凋亡率Fig.2 The apoptosis rates of SU-DHL-4 and U2932 cells treated with YY-20394 were detected by flow cytometry

2.3 YY-20394影响DLBCL细胞的基因表达

用3.30µmol/L（IC50）的YY-20394处理SU-DHL-4细胞24 h后进行RNA-Seq测序并绘制火山图，如图3A显示，SU-DHL-4细胞共检测到600个差异表达基因，包括259个上调基因和341个下调基因；另外，挑选表达差异最显著的前20个基因绘制热图（图3B），结果显示YY-20394处理后SU-DHL-4细胞的基因表达发生了显著变化。而YY-20394处理U2932细胞后仅检测到3个下调基因（AC026464.2、SNORD14D、MIR155HG）；12个上调基因（MIR4426、AL671277.1、MIR4538、AC018638.1、SLC6A6、MIR4539、PRR15L、AC099811.2、RN7SL2、SNORD104、RN7SL1、CORO7-PAM16）。

图3 YY-20394影响SU-DHL-4细胞的基因表达Fig.3 YY-20394 affected gene expression in SU-DHL-4 cells

2.4 生物信息学分析YY-20394 对SU-DHL-4 细胞的抗肿瘤作用

将YY-20394 处理SU-DHL-4 细胞后检测到的差异基因进行KEGG 富集分析，结果（图4A）显示，药物处理细胞后，细胞的氨基酸代谢、自然杀伤细胞介导的细胞毒性作用和细胞凋亡信号通路等重要细胞生物学功能途径被激活；而cGMP-PKG、cAMP、mTOR、AMPK、PI3K-AKT、Ras、NF-κB、BCR、JAK-STAT 等重要信号通路显著下调，同时磷酸戊糖途径、类固醇的合成、DNA的复制和细胞周期等重要的细胞功能也被显著抑制，提示PI3K 抑制剂可能诱导了这些信号通路活性变化，从而导致SU-DHL-4 细胞的生长抑制和凋亡，发挥抗肿瘤作用。GO 功能注释分析结果（图4B）显示，在YY-20394处理SU-DHL-4细胞后差异表达基因主要定位在核糖体、核糖体亚基、胞质大核糖体亚基和内质网中，与胆固醇及其他醇类合成、与代谢及核转录的mRNA分解、靶向膜的信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）依赖的共翻译蛋白等生物学过程相关，且与NADP 合成、核糖体结构组成的分子功能相关。另外，对YY-20394 处理SU-DHL-4细胞前后的肿瘤相关信号通路进行GSEA富集分析，结果（图4C）显示，Hedgehog、JAK-STAT、MAPK、NF-κB、Notch、PI3K-AKT、Wnt 等信号通路在SU-DHL-4 细胞的未加药组中显著富集，而YY-20394 处理后上述通路的激活水平显著降低。然而，YY-20394处理U2932细胞后，KEGG 富集分析未富集到具有显著水平的信号通路。

图4 生物信息学分析YY-20394对SU-DHL-4细胞的抗肿瘤作用Fig.4 The anti-tumor effect of YY-20394 on SU-DHL-4 cells was analyzed by bioinformatics

进一步利用GSEA 富集分析YY-20394 处理后SU-DHL-4 细胞和U2932 细胞的PI3K-AKT 信号通路富集情况，结果（图4D）显示，PI3K-AKT 信号通路在SU-DHL-4 细胞中富集，而在U2932 细胞中的活化程度低，推测这可能是YY-20394 对U2932 细胞无明显抗肿瘤作用的原因。

3 讨论

PI3K-AKT 信号通路在肿瘤的增殖、存活、细胞运动、抵抗凋亡、血管发生和转移以及对化疗耐药、放疗抵抗中发挥了重要作用［11-12］。为探讨PI3K 在DLBCL治疗中的价值，本研究使用一种新的PI3K抑制剂YY-20394 并研究其对DLBCL 细胞的作用。本研究发现YY-20394 能抑制GCB 亚型DLBCL 细胞株SU-DHL-4细胞的生长，促使细胞凋亡，且其效应随药物作用时间延长和药物浓度增高而增强。但是，在ABC亚型的U2932 细胞中未能观察到明显的细胞增殖抑制和促凋亡现象。目前研究认为，BCR 信号活化在ABC 型DLBCL 的发生发展中起着重要作用［13］，该信号的一个主要特征是BTK 和NF-κB 信号通路的构成性激活［14］，但是GCB亚型DLBCL缺乏这种信号。另外，有研究发现GCB 亚型DLBCL 的发生依赖于另一种信号BCR 信号：强直性BCR 信号，该信号通路的激活被认为与抗原无关，其特征是基线NF-κB 活性较低，但PI3K-AKT 信号通路活性增加［15］。因此，PI3K 抑制剂YY-20394有望用于治疗GCB亚型DLBCL。

本研究还发现YY-20394 作用于SU-DHL-4 细胞后存在多个基因的表达发生改变，并且GSEA 分析发现7 条跟肿瘤密切相关的信号通路发生了改变，包括PI3K-AKT、NF-κB、MAPK、JAK-STAT、Notch、Wnt 和Hedgehog 信号通路，PI3K 抑制剂YY-20394 显著抑制了上述信号通路的激活。目前已知BCR、PI3K/AKT等信号通路与DLBCL 预后密切相关，在DLBCL 的发生发展中起关键作用［16-18］。在KEGG 富集分析和GO 功能注释分析中，还观察到了DNA 的复制和细胞周期调控等重要的细胞功能在药物作用后也被显著抑制。这些研究结果进一步揭示了PI3K抑制剂对SU-DHL-4细胞抗肿瘤作用的机制。然而，YY-20394处理U2932细胞后，KEGG 富集分析未富集到具有显著水平的信号通路。另外，GSEA 富集分析发现PI3K-AKT 信号通路在SU-DHL-4 和U2932 两种细胞中的富集水平具有显著差异，PI3K-AKT 信号通路在GCB 亚型的SU-DHL-4细胞中活化水平高，而在ABC亚型的U2932细胞中活化水平低，推测这可能是PI3K抑制剂对ABC亚型DLBCL患者疗效不佳的原因。

目前，PI3K 抑制剂在滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和小淋巴细胞淋巴瘤具有较好的疗效，但是在复发/难治性DLBCL 中的治疗效果并不理想［19-20］，其原因可能是其中的分子作用机制有所不同。本研究发现PI3K 抑制剂对GCB 亚型DLBCL 细胞SU-DHL-4增殖抑制和凋亡诱导具有明显的作用，而对ABC亚型DLBCL 细胞U2932 不敏感，推测PI3K-AKT 信号通路可能不是影响ABC 亚型DLBCL 细胞增殖生长最主要的信号通路，并且该信号通路在两种细胞的富集水平分析结果也充分证明了其在U2932 细胞中活化水平不高。但是，由于本研究仅在细胞层面探讨了PI3K 抑制剂YY-20394 的抗肿瘤作用，未来仍需在体内进一步验证其作用。