黄色短杆菌中L-异亮氨酸同位素丰度及分布的分析方法研究

赵雅梦，范若宁，雷 雯*

（1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.上海市稳定同位素检测及应用研发专业技术服务平台，上海 200062）

利用同位素标记技术将化合物中普通原子替换为同位素核素所合成的稳定同位素标记化合物，结合质谱技术，已在蛋白质组学、代谢组学、生物靶标发现、临床诊断等生命科学研究中发挥重要作用［1-4］。13C、15N标记赖氨酸、精氨酸等是细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记技术（SILAC）中必备的关键试剂［5-6］，也是代谢流量分析中的常用示踪剂［7-8］。微生物发酵法是同位素标记氨基酸的主要合成方法，将培养基中的营养组分替换为稳定同位素标记化合物，经微生物发酵、提纯等即可得到同位素标记氨基酸［9-10］。同位素丰度是稳定同位素标记氨基酸产品的重要参数之一，决定了批次产品的质量水平，也是稳定同位素标记氨基酸在蛋白质定量、代谢流等下游应用研究中的重要考察指标。高丰度稳定同位素标记氨基酸产品的应用需求大，对试剂质量要求也较高。

目前，气体同位素质谱法和有机质谱法是同位素丰度分析的两种重要方法，前者通过高温燃烧等方式将C、N元素转化为CO2和N2，适用于检测纯度较高的同位素试剂［11］。后者则是基于化合物同位素质量数的差异完成丰度计算，如上海化工研究院开发的基于“质量簇”的有机质谱同位素丰度［12-13］。近年来，高分辨质谱仪因具有超高分辨率、高灵敏度等特点成为同位素丰度和分布分析的主流工具。研究人员利用高分辨质谱仪建立了针对氘标记化合物［14］、13C标记葡萄糖［15］等的同位素分布及丰度检测方法，可实现复杂样本中化合物的丰度计算，生产过程的实时监控，以及有效的降低成本等明显优势。

本研究基于同位素标记技术，通过色谱、质谱条件的优化及对样品浓度、质谱扫描次数等影响因素的考察，建立了一种稳定、准确的氨基酸同位素丰度计算方法，实现了L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌发酵液中氨基酸同位素丰度及分布分析，可为发酵反应条件优化、细菌代谢机理研究等提供数据支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Orbitrap Exploris 120高分辨液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Fisher 科技有限公司）；MAT 271 型气体同位素质谱仪（美国 Finnigan 质谱公司）；XPE105DR 电子天平仪（瑞士Mettler Toledo 集团）；Vortex-5涡旋仪（中国其林贝尔仪器制造有限公司）；Merck-Milipore SimolicityTM超纯水系统（德国Merck公司）。

葡萄糖-13C6（纯度为99%，美国剑桥实验室）；L-谷氨酸-15N、L-异亮氨酸-15N、L-亮氨酸-15N、L-赖氨酸-15N、L-苯丙氨酸-15N、L-脯氨酸-15N、L-苏氨酸-15N、L-缬氨酸-15N（纯度均＞99%，上海化工研究院有限公司）；甲醇、甲酸、乙腈（ACN）（色谱纯，美国Thermo Fisher科技有限公司）。

1.2 标准溶液的配制

准确称取1.0 mg 氨基酸样品，加入1 mL 50%甲醇水溶液，涡旋30 s 充分混匀，配成质量浓度为1.0 mg/mL 的储备液。准确移取适量储备液，以50%甲醇水溶液稀释成0.1、0.2、0.5、0.8、1、2 μg/mL的工作标准溶液。储备液和工作标准溶液均保存于4 ℃。

1.3 实验条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：Hypersil Gold Vanquish 色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.9 μm）；流动相：流动相A 为超纯水，流动相B 为含0.1%甲酸的甲醇溶液；洗脱条件：90% B 等度洗脱5 min；流速：0.3 mL/min；进样量：1 μL。

1.3.2 质谱条件离子源：ESI；电喷雾电压（Ion sray voltage）：3 200 V；鞘气（Sheath gas）：20 arb（～2.68 L/min）；辅助气（Aux gas）：15 arb（～14.03 L/min）；离子传输管温度：320 ℃；扫描模式：全扫描（Full scan）模式下正离子扫描；分辨率：12 000；扫描质荷比范围：70～500m/z。

1.4 细菌培养

L-异亮氨酸产生菌菌种为黄色短杆菌（Brevibacterium flavum），发酵培养基组分为：12 g/L 葡萄糖，3 g/L（NH4）2SO4，0.5 g/L 玉米浆，0.1 g/L K2HPO4，0.025 g/L MgSO4，0.02 g/L FeSO4，0.02 g/L MnSO4，0.01 g/L VB1，0.01 g/L 生物素，pH 7.2。菌种活化、培养及分离纯度等过程参照文献进行［10］。L-异亮氨酸-15N 发酵生产时，将（NH4）2SO4替换为（15NH4）2SO4；13C同位素示踪研究时，将发酵培养基组分中的葡萄糖换为20%葡萄糖 -13C6和80%葡萄糖。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱-质谱条件的优化

色谱柱是液相色谱的核心，由于本文只针对L-异亮氨酸进行分析，且采用的是液相色谱-质谱联用方法，因此选择高稳定性和重现性的C18色谱柱进行分析。分别以乙腈-水、甲醇-水作为流动相考察了L-异亮氨酸-15N 的保留及色谱峰形情况。由图1 可知，以乙腈-水为流动相时，样品在0.8 min 出峰，且在1 min 左右有杂峰出现。而更换流动相为甲醇后，由于甲醇洗脱能力弱于乙腈，保留时间略有延后，但峰形显著变好，因此选择甲醇-水流动相体系。在甲醇中加入0.1%甲酸时，信号响应有所提高，这可能是因为酸性条件促进了氨基酸的电离。因此最佳流动相条件选择以水为A 相，含0.1%甲酸的甲醇为B相。

图1 不同流动相条件下L-异亮氨酸-15N的提取离子流图Fig.1 Extracted ion chromatograms（EIC） of L-isoleucine-15N under different mobile phase conditions

为保证待测物具有良好的质谱响应，对离子化模式和喷雾电压、鞘气及辅助气等离子源参数进行优化。L-异亮氨酸含有羧基和氨基官能团，在正、负离子模式下均出峰且信号响应较好，本文参照文献选择正离子模式进行实验［16］。电离电压等离子源参数优化可有效提高待测物的信号响应和检测灵敏度。研究显示，喷雾电压的提高可增强L-异亮氨酸-15N 的质谱响应信号，但过高电压可能会发生源内裂解而影响同位素丰度的计算，因此选择3 200 V 为最佳喷雾电压。进一步考察鞘气和辅助气的影响，结果显示鞘气和辅助气分别为20 arb（～2.68 L/min）和15 arb（～14.03 L/min）时，待测物的响应信号最佳。

2.2 同位素丰度计算的影响因素

当同位素标记化合物的相对同位素偏差大于仪器质量偏差时，可直接参照行业标准进行同位素丰度计算［17］，如13C、D 标记的化合物均可根据LC-HRMS 的质谱图进行丰度计算。以L-异亮氨酸-15N 为例，计算得到L-异亮氨酸-15N的同位素偏差为45 ppm，远大于仪器质量偏差（5 ppm），因此可直接根据质谱峰强度进行丰度计算。

2.2.1 样品浓度的影响当L-异亮氨酸-15N浓度过低时，存在背景干扰大、部分同位素标记形式低于阈值而无法检出等情况；然而样品浓度过高时可能会导致质谱残留而影响后续使用。本实验考察了不同浓度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL）L-异亮氨酸-15N 标准溶液对实验结果的影响。结果显示，当样品浓度较低时，测得的丰度较低且偏差较大。随着样品浓度的提高，同位素丰度逐渐提高，在1 μg/mL及以上浓度时趋于稳定（见图2）。因此后续采用1 μg/mL样品浓度进行实验。

图2 不同浓度下L-异亮氨酸-15N的同位素丰度计算结果Fig.2 Isotopic abundances of L-isoleucine-15N at different concentrations

2.2.2 同位素丰度计算依据同位素丰度是依据质谱图中不同标记形式化合物的信号响应进行计算［13-18］，目前多以质谱峰强度和峰面积进行计算［19］。考察了这两种计算形式下同一样品的同位素丰度，结果显示根据峰面积计算得到的同位素丰度为98.66%，相对标准偏差（RSD）为0.03%；根据峰强度计算得到的同位素丰度为98.67%，相对标准偏差为0.04%。二者基本一致，说明对于高丰度同位素标记化合物，采用峰面积或峰强度均可得到较为准确的计算结果。但由于采用峰强度计算时只需对一定数量质谱图进行叠加，使用峰面积时需对不同形式的峰面积进行积分，相对复杂。因此后续以峰强度进行丰度计算。

2.3 不同检测方法对比

气体同位素质谱法是同位素丰度测定的常用方法，也是同位素试剂质量控制的重要手段之一。本文以L-谷氨酸-15N、L-赖氨酸-15N 等多种15N 标记氨基酸为例，对比了气体同位素质谱法（GIMS）与LCHRMS两种方法计算结果的差异。如表1所示，两种计算方法得到的同位素丰度值差值均在0.6%以内，LC-HRMS 计算得到的丰度值普遍高于GIMS 的结果，这可能是由于两种检测方法原理不同所致。与GIMS 法相比，LC-HRMS 法所需样品量少，且无需气体转化等前处理，操作简便，实验时间短，有望成为一种高通量、准确的稳定同位素试剂质量控制方法。

表1 GIMS及LC-HRMS的氨基酸15N同位素丰度测定结果对比Table 1 Comparison of 15N isotope abundance measurements between GIMS and LC-HRMS in isotope labeled amino acid

2.4 方法应用

生物发酵法是国内制备15N 标记氨基酸的主要方法，采用GIMS 进行丰度分析时，需要得到氨基酸纯品后再进行分析，若试剂产品质量不合格则需重新进行培养、纯化等步骤。而基于LC-HRMS 的丰度分析方法简便快捷，杂质干扰小，可直接对菌液进行分析。以L-异亮氨酸-15N 产生菌黄色短杆菌菌液为例，在发酵过程中，可能存在赖氨酸等杂质干扰，如图3 所示，尽管菌液成分复杂，但L-异亮氨酸-15N的提取离子流图信号响应很高，经计算得到15N同位素丰度为98.58%，相对标准偏差为0.03%。

图3 L-异亮氨酸-15N产生菌黄色短杆菌菌液的离子流图（A）和质谱图（B）Fig.3 EIC chromatograms（A） and MS spectra（B） of L-isoleucine-15N producing bacteriophage of Brebvibacterium flavum

将该方法进一步用于13C6-葡萄糖示踪的黄色短杆菌中同位素分布及丰度分析，在4～72 h 等不同时间点取样（见表2）。结果显示，随着示踪时间的增加，L-异亮氨酸-15N 的同位素丰度逐渐升高，48 h后基本达到平衡，同位素丰度值约为19 atom %13C，与培养基中同位素试剂的添加比例一致，同位素分布如图4 所示。除同位素丰度计算外，基于本方法得到的同位素分布也可为代谢流分析、细菌代谢机理阐明等研究提供基础。

表2 不同示踪时间下13C标记异亮氨酸的同位素丰度Table 2 Isotope abundance of 13C6-isoleucine within different tracing time

图4 不同示踪时间下13C标记异亮氨酸的质量分布图Fig.4 Isotope abundance of 13C labeled isoleucine within different tracing time

3 结 论

本研究建立了一种可用于L-异亮氨酸同位素分布及丰度分析的LC-HRMS 检测方法。方法准确可靠，稳定性良好，且所需样品量少，操作简便，尤其适用复杂生物样品如细菌发酵液中L-异亮氨酸同位素丰度与分布的快速检测，可为工程菌株设计、培养体系筛选等科学研究提供支持，提高稳定同位素标记氨基酸产品的产量，助力生命科学和生物医药领域的发展。