基于下丘脑瘦素受体介导的JAK2/STAT3通路探讨穴位埋线治疗食源性肥胖大鼠的中枢机制

张荣， 伍先明， 杨硕， 莫倩

（1.贵州中医药大学，贵州贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州贵阳 550003）

肥胖是心脑血管等疾病的高危因素，我国肥胖发生率逐年升高[1]。肥胖防治问题亟需解决。机体能量代谢紊乱是导致肥胖发生的重要原因。下丘脑是调控机体能量稳态的重要高级中枢[2]，而瘦素（leptin）是中枢神经系统调节机体能量代谢的关键上游因子，主要通过下丘脑长型瘦素受体（LepR）介导的Janus激酶2（JAK2）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）通路传递能量代谢信号[3]。穴位埋线减肥在临床上已被证实是一项安全有效的方法[4]。团队前期研究发现，以中脘、水道、天枢、脾俞、胃俞、三焦俞等穴组方，穴位埋线治疗肥胖症临床疗效显著[5-6]，其机制可能与调控血清瘦素的表达从而良性调节外周脂肪代谢有关[7-8]，但是否同时影响中枢有待于进一步研究。因此，在前期研究的基础上，本研究以下丘脑LepR介导的JAK2/STAT3通路为切入点，观察该通路在正常状态下及被特异性阻断剂AG490 阻断时，穴位埋线对食源性肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠减重降脂效用变化，初步探讨穴位埋线治疗肥胖症的中枢机制，以期为临床治疗本病提供科学佐证，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 健康SPF 级雄性SD 大鼠40 只，1 月龄，体质量120～140 g，购自第三军医大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（渝）2017-0002，饲养于贵州中医药大学动物实验中心，光照12 h 昼夜交替，室温（23±2）℃，湿度（40±5）%。本研究获得贵州中医药大学第二附属医院伦理委员会批准（审批号：2015088）。动物的处置严格遵照《关于善待实验动物的指导性意见》[9]。

1.2 试剂与仪器 AG490（美国MCE公司）；甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）生化检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；瘦素检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；RNA 提取及纯化试剂盒（德国Qiagen 公司）；RNA 逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒（日本TaKaRa公司）；LepR兔多抗、JAK2 兔单抗、STAT3兔单抗（美国Abcam公司）；β-actin抗体、羊抗兔IgG二抗（北京博奥森生物技术有限公司）。7号一次性埋线针（苏州市吴中区东方针灸器械厂）；3-0号羊肠线（上海信成医疗器械有限公司）；凝胶扫描成像系统、CFX96荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；酶标仪、核酸蛋白测定仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1. 3 模型制备与分组 大鼠适应性喂养1 周后，采用随机抽样的方法选取10 只作为正常组，给予普通饲料饲养。剩余30 只大鼠给予高脂饲料（配方：普通饲料60%，猪油12%，鸡蛋10%，花生、奶粉、蔗糖各5%，食盐2%，麻油1%，由北京科澳协力有限公司配制）饲养25 周建立DIO 模型[10-11]，自由摄食、饮水。25周后体质量高于正常组平均体质量20%及以上的示为造模成功[12]。将DIO 造模成功后的大鼠随机分为模型组、埋线组、埋线+AG490组，每组10只。

1. 4 干预方法 埋线组、埋线+AG490 组在造模成功后第1、8、15、22 天进行埋线治疗，操作方法：参照文献研究[13-16]选取中脘、水道、天枢、脾俞、胃俞、三焦俞等穴位，自制固定架固定大鼠，穴区皮肤备皮，将0.5~0.6 mm 的3-0 号羊肠线用7 号一次性埋线针埋入上述穴位的脂肪层[7]，共治疗4 次。埋线+AG490 组埋线期间每天腹腔注射AG490（1 mg/kg）[17]。正常组和模型组仅抓取固定。干预期间，各组均用普通饲料饲养，自由饮水摄食。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 样本采集 治疗结束后大鼠禁食过夜，腹主动脉取血，离心后将上清液转移到无菌EP 管中，-80 ℃冰箱冷冻保存。处死大鼠后迅速取下丘脑组织分装至无酶EP 管，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。

1.5.2 血清生化指标及瘦素检测 采用ELISA 方法检测各组血清TG、TC、LDL-C、HDL-C及瘦素水平，检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1. 5. 3 Western Blot 法检测下丘脑LepR、JAK2、STAT3蛋白表达 提取下丘脑总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。根据目的蛋白的分子量配制相应浓度的分离胶和浓缩胶，以β-actin 为内参，采用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（恒压60 V 持续1 h，120 V 持续30 ~40 min），湿转法转膜（恒流，250 mA，约3 h），封闭，TBST 洗膜。分别加入一抗（LepR 1∶1 500，JAK2 1∶5 000，STAT3 1∶2 000，β-actin 1∶5 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜，加入羊抗兔IgG 二抗（稀释比例为1∶10 000）孵育1.5 h。TBST洗膜后再加入增强化学发光（ECL）显影剂，放入化学发光成像系统，进行自动曝光，并保存图片。用Image Lab Software 5.2分析条带，计算灰度值。

1.5.4 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测下丘脑中LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表达 提取下丘脑总RNA 并检测其浓度及纯度。逆转录生成cDNA。按PCR 扩增试剂盒配制反应液进行扩增，反应程序：预变性95 ℃、30 s；变性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，扩增39 个循环；变性95 ℃、10 s，延伸65 ℃、5 s，酶瞬间灭活97 ℃、5 s。以GAPDH 为内参，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1. 6 统计方法 采用SPSS 26.0 软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。如果方差齐，进一步两两比较采用LSD 检验；如果方差不齐，两两比较则采用Tamhane’s T2 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠干预前后体质量比较 图1 结果显示：干预前，与正常组比较，模型组、埋线组、埋线+AG490组大鼠体质量均升高（P＜0.01），提示DIO 造模成功；与模型组比较，埋线组、埋线+AG490 组体质量无显著性差异（P＞0.05），具有可比性。干预后，与模型组比较，埋线组体质量降低（P＜0.01）；与埋线+AG490组比较，埋线组体质量降低（P＜0.01）。

图1 各组大鼠干预前后体质量比较Figure 1 Comparison of body mass among various groups of rats before and after intervention

2. 2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量比较 图2结果显示：与正常组比较，模型组TG、TC、LDL-C 含量均升高（P＜0.05），HDL-C无显著性差异（P＞0.05）；与模型组比较，埋线组TG、TC、LDL-C 含量降低（P＜0.05），HDL-C 无显著性差异（P＞0.05）；与埋线+AG490组比较，埋线组TG、TC、LDL-C含量降低（P＜0.05），HDL-C无显著性差异（P＞0.05）。

图2 各组大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较Figure 2 Comparison of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C levels among various groups of rats

2.3 各组大鼠血清瘦素比较 图3 结果显示：与正常组比较，模型组瘦素水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，埋线组瘦素水平降低（P＜0.01）；与埋线+AG490 组比较，埋线组瘦素水平降低（P＜0.05）。

图3 各组大鼠血清瘦素水平比较Figure 3 Comparison of serum leptin level among various groups of rats

2. 4 各组大鼠下丘脑组织LepR、JAK2、STAT3 mRNA表达水平比较 图4结果显示：与正常组比较，模型组LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表达水平均降低（P＜0.01）；与模型组比较，埋线组LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表达量均升高（P＜0.01）；与埋线+AG490 组比较，埋线组LepR、JAK2、STAT3 mRNA表达量均升高（P＜0.01）。

图4 各组大鼠下丘脑组织中的LepR、JAK2、STAT3 mRNA表达水平比较Figure 4 Comparison of mRNA expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

2. 5 各组大鼠下丘脑组织LepR、JAK2、STAT3蛋白表达水平比较 图5 结果显示：与正常组比较，模型组LepR、JAK2、STAT3 蛋白表达水平均降低（P＜0.01）；与模型组比较，埋线组LepR、JAK2、STAT3 蛋白表达水平均升高（P＜0.01）；与埋线+AG490组比较，埋线组LepR、JAK2、STAT3蛋白表达水平均升高（P＜0.01）。

图5 各组大鼠下丘脑组织中的LepR、JAK2、STAT3蛋白表达水平比较Figure 5 Comparison of protein expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

3 讨论

中医学认为，肥胖多与饮食不节、劳逸失调等因素有关，基本病机为脾胃虚衰，运化功能失常，痰湿聚集，壅滞脏腑经络[18]，病位主要在脾胃，故肥胖治疗多以调脾胃、祛痰湿为主。本团队前期临床研究[5-6]显示，穴位埋线治疗肥胖症临床疗效显著，且基础研究[7-8]结果显示，在降低肥胖大鼠体质量、Lee’s指数以及调节外周脂质代谢方面，脂肪层埋线效果优于肌肉层埋线。因此，本研究采用脂肪层穴位埋线的方法，选取脾胃经之背俞穴脾俞、胃俞以健脾和胃，胃、大肠经之募穴中脘、天枢以和胃气，调节胃肠，配合水道、三焦俞以疏利三焦、通调水道，达健脾胃、祛痰湿、利水道之功。结果显示，脂肪层穴位埋线可显著降低食源性肥胖（DIO）大鼠的体质量，下调血清TG、TC、LDL-C水平，调节脂质代谢。

目前肥胖动物多以饮食诱导为主[19]，故本研究以高脂饮食诱导建立DIO 模型，以体质量超过同期普通饲料饲养大鼠的20%为造模成功的标准[12]。

肥胖的发生是遗传、社会环境等因素共同作用的结果。下丘脑是机体调控能量平衡和代谢的高级中枢，是导致肥胖患者脂肪组织聚集的关键区域，同时也是瘦素发挥作用的主要靶器官[20]。瘦素是防治肥胖的重要靶点，具有减少能量摄入、促进能量消耗、抑制脂肪合成并促进其分解的生理功能，同时作为“信使”，向中枢神经系统反映机体能量储存情况[21]。既往临床研究[22]显示，肥胖患者血清瘦素水平偏高，但不能抑制食欲，提示机体对瘦素的代谢性调节作用敏感性降低，这种现象称为“瘦素抵抗”。出现“瘦素抵抗”的原因错综复杂，JAK2/STAT3 通道活性降低是导致机体出现“瘦素抵抗”重要原因之一[23]。下丘脑LepR介导的JAK2/STAT3通路是目前已知的瘦素发挥调节机体能量代谢的主要信号通路，瘦素正常生物学效应的发挥与JAK2/STAT3 通路活性呈正相关。瘦素经血液循环穿过血脑屏障到达下丘脑，与长型LepR 结合后通过激活JAK2，使LepR 上的酪氨酸残基磷酸化，被磷酸化的酪氨酸残基通过特异性的招募结合使STAT3活化并形成二聚体，STAT3二聚体转移至细胞核内通过调节目的基因的转录从而发挥瘦素作用[24]。

本研究结果显示：穴位埋线后，DIO大鼠体质量，瘦素，TG、TC、LDL-C 水平降低，LepR、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白表达升高，说明穴位埋线能够激活LepR 介导的JAK2/STAT3 通路，纠正瘦素抵抗。AG490 可通过与受体酪氨酸酶竞争结合位点特异性阻断JAK2/STAT3 通路[25]。穴位埋线的同时腹腔注射AG490，DIO大鼠各项指标与模型组相当，基本上抵消了穴位埋线的治疗效应。这一结果双重证明：下丘脑LepR 介导的JAK2/STAT3通路参与了穴位埋线降低DIO大鼠体质量的调节过程。

综上所述，穴位埋线对DIO 大鼠具有良好的减重降脂作用，其中枢作用机制可能与下调血清瘦素水平，激活下丘脑LepR 介导的JAK2/STAT3通路有关。本研究为临床上采用穴位埋线治疗肥胖症提供了一定的科学依据，但也存在一些不足，如虽采用公认的饮食诱导建立DIO 模型，但造模成功的评价标准较为单一，可能对实验结果有一定的影响，且观察指标中未纳入下丘脑相关的形态学指标进行分析。研究中还发现，抑制JAK2/STAT3通路后，LepR、JAK2 mRNA水平也有所改善，推测穴位埋线可能同时通过其他中枢或外周途径调节机体能量代谢，今后有待采用光遗传等先进科学技术进一步验证。