绿色草莓再生体系的建立

潘娇艳, 肖世伟, 夏 瑾, 倪知游, 邹雨婷, 乔玉山,

(1.南京农业大学园艺学院,江苏 南京 210095; 2.江苏省农业科学院果树研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京 210014)

建立高效的离体再生体系是构建遗传转化体系的基础,也是开展植物基因工程研究必要的前提条件之一,对于进一步利用转基因、基因编辑等技术研究草莓基因功能、品种改良及种质创新具有重要意义。不同草莓品种的再生效率及遗传转化效率存在较大差异,一些栽培草莓(Fragaria×ananassaDuch.)品种的再生体系及遗传转化体系已经建立,如全明星[1]、早红[2]、晶瑶[3]、红颜[4]等。野生草莓拥有风味独特、抗逆性强等优良性状,是改良栽培品种的潜在资源[5]。国外已经建立了部分森林草莓(F.vesca)高效、稳定的再生体系及遗传转化体系[6-9];国内也建立Hawaii 4[10]、Ruegen[11]、Yellow Wonder[12]等森林草莓的再生体系,但这些株系的遗传转化体系还需要进一步研究。黄毛草莓(F.nilgerrensisSchltdl. ex J.Gay)茎尖培养体系、组培苗快繁体系、叶片离体再生体系也先后建立起来[5,13]。绿色草莓(FragariaviridisWeston)属于二倍体野生草莓,具有抗逆性强、果实硬度高等优良性状,同时具有基因组小等优点,在栽培草莓品种改良上具有利用价值[14],但关于其再生体系及遗传转化体系的研究还比较少。本研究拟以田间自然生长的绿色草莓匍匐茎为外植体,从初代培养开始逐步研究绿色草莓的再生体系,以期为其遗传转化体系的建立奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用绿色草莓的株系为GE-39。2021年4-6月采集田间幼嫩匍匐茎进行初代培养,进而获得试管苗,其他培养材料为试管苗的幼叶及由其诱导产生的愈伤组织。

基本培养基为MS培养基或1/2 MS培养基,均附加3.0%蔗糖和0.7%琼脂,121 ℃/116 ℃灭菌20 min/30 min。高温灭菌前,将培养基的pH值调节至5.8～5.9。培养室温度为(25±1) ℃,光照周期为16 h/8 h,光照度为2 000 lx。

1.2 试验方法

1.2.1 试管苗的建立 将田间取回的匍匐茎用流水冲洗3～5 h,在超净工作台将匍匐茎保留3～5 cm的茎尖用70%的乙醇消毒30～40 s,消毒结束时用无菌水冲洗3～4次,再用10%的次氯酸钠消毒10 min,用无菌水再次冲洗3～4次,用灭菌滤纸吸干茎尖表面水分,切除茎尖下端少许,然后接种到MS、MS+0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L赤霉素(GA3)初代培养基中,每瓶接种1个茎尖,观察并记录茎尖的生长状况,30 d后统计成活率。

1.2.2 试管苗的增殖 茎尖在初代培养基中成活后获得试管苗,将长势相近的试管苗接种至不同增殖培养基中。增殖培养基以1/2 MS为基本培养基,植物生长调节剂组合为:6-BA与吲哚丁酸(IBA)、6-BA与GA3、6-BA与吲哚乙酸(IAA)。6-BA质量浓度梯度设置为0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L,IBA、GA3、IAA的质量浓度梯度均设置为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L。每个培养基接种3株试管苗,观察并记录植株的生长状况,培养28 d后对比不同处理对绿色草莓增殖系数(增殖系数=再生芽总数/接种芽数)的影响。

1.2.3 不同植物生长调节剂组合对叶盘脱分化的影响 选取叶龄为30 d的健康试管苗叶片,剪去叶片四周少许,再沿垂直于叶片中脉方向横切,形成近似方形且大小相近的叶盘。将叶盘背面朝下平铺于叶盘脱分化培养基中,均匀摆放。叶盘脱分化培养基以MS为基础培养基,并设置不同植物生长调节剂组合(表1)。每个培养基放置8～15个叶盘,暗培养7 d后分为两部分,一部分继续放在黑暗环境中培养,另一部分置于光下培养。每天观察并记录叶盘的生长状况、愈伤组织的发生情况,每隔14 d更换一次培养基。培养30 d后计算出愈率(出愈率=长出愈伤组织的叶盘数/接种的叶盘总数×100%)。

表1 叶盘脱分化培养基

1.2.4 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织再分化的影响 本研究发现叶盘在适宜脱分化培养基中产生的愈伤组织经相同培养基继代培养后,渐渐出现褐化甚至死亡的现象,不产生不定芽,因此需探索适宜的愈伤组织再分化培养基。将愈伤组织接种至不同的愈伤组织再分化培养基(表2)中,基础培养基为1/2 MS,每个培养基放置4～6个愈伤组织。在培养过程中统计愈伤组织再分化率(再分化率=可再分化的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100%)及平均分化芽数(平均分化芽数=不定芽总数/可再分化的愈伤组织数),并记录再生不定芽的生长状态。

表2 愈伤组织再分化培养基

1.2.5 试管苗生根诱导及炼苗移栽 选择生长状况良好且长势相近的试管苗接种至不同的生根培养基中,生根培养基以1/2 MS为基础培养基,植物生长调节剂为IAA、IBA、IBA+IAA。IAA、IBA的质量浓度均设置为0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L,每个培养基接种3株试管苗,培养30 d后记录试管苗根系的生长状况、苗的长势并统计生根率。

将试管苗或再生的芽接种到最佳生根培养基中,经过30 d的生根培养后,对根系健壮的试管苗开盖放置3～5 d,炼苗期间注意观察试管苗的生长状况,及时向叶面喷水补充水分。炼苗结束后洗净幼苗根部培养基,并用多菌灵水溶液浸泡根系10 s。将草莓苗移栽至经高温消毒的基质中,基质成分包含营养土、蛭石与珍珠岩,其体积比为9∶3∶1,在室温条件下缓苗2～3 d后转移至适宜环境中,30 d后统计成活率,成活率=成活植株数/总移栽植株数×100%。

2 结果与分析

2.1 绿色草莓试管苗的建立

试管苗的建立是绿色草莓再生体系建立的首要步骤,本研究对绿色草莓初代培养的研究结果表明,在不添加任何激素的MS培养基中茎尖的成活率相对较低,为13.3%,长势较弱且褐化相对严重;而接种在MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培养基中的茎尖生长发育较为健康且能保持较为活跃的生命力,褐化现象较少。其中,在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培养基中,茎尖的生长状况最为活跃,成活率最高,为46.6%,且有少量侧芽萌发(图1),而在MS+0.5 mg/L 6-BA培养基中茎尖的成活率仅为26.6%,因而添加GA3的培养基更适用于绿色草莓的初代培养。绿色草莓的初代建立需要经过一系列的消毒步骤,茎尖的生活力受到影响,因此与增殖培养相比,初代建立所需要的时间更长。

A:绿色草莓茎尖在MS+0.2 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.2 mg/L赤霉素(GA3)培养基中培养0 d时的生长状况;B:绿色草莓茎尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培养基中培养30 d时的生长状况。

2.2 不同培养基对试管苗增殖的影响

不同植物生长调节剂组合对绿色草莓的增殖效果不同,但绿色草莓增殖系数的高低主要由6-BA决定。在含有0.2 mg/L IAA的增殖培养基中,绿色草莓的增殖系数随着6-BA质量浓度的升高而提高;但是当绿色草莓的增殖系数过高时,幼苗在有限的空间内相互挤压,植株的生长势变弱,表现出根系短小、茎叶细弱、略有黄化的现象。在培养基中包含0.1 mg/L的6-BA时,添加0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L的IBA或IAA,均可获得明显的增殖效果,且植株形态正常,生长状况良好;而添加0.3 mg/L的GA3时,增殖效果一般,但植株更健壮,叶片肥大鲜绿(图2A)。综合分析,当培养基中添加0.1 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IBA时,绿色草莓的增殖效果最好,增殖系数为6.4,所诱导产生的草莓苗不但健壮而且叶片鲜绿(图2B)。

A:绿色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.3 mg/L赤霉素(GA3)培养基中培养28 d时的生长状况;B:绿色草莓在1/2 MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L吲哚丁酸(IBA)培养基中28 d时的生长状况。

2.3 不同培养基对诱导叶盘脱分化的影响

使用不同培养基诱导叶盘脱分化的研究结果表明,叶盘在MS+2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)+噻苯隆(TDZ,1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)培养基中连续暗培养24 d时多在周围刻伤处形成白色的愈伤组织,质地较软,在这些培养基中叶盘出愈率均为100%。将白色愈伤组织转移到光照下继续培养,其颜色逐渐变为嫩黄色,愈伤组织快速增殖且质地紧密,但无不定芽分化现象(图3)。叶盘在相同培养基中暗培养7 d后转移至光下培养23 d,其脱分化效果不明显。叶盘在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA培养基中连续暗培养30 d后,出愈率也为100%,但叶盘产生的愈伤组织面积不大,多呈黄白色或黄褐色,长势较差,在相同的培养基连续继代培养后,愈伤组织硬化、不具有生命活力。在TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、6-BA(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)+NAA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)、1.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA、1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA培养基中,无论是连续暗培养还是暗培养7 d后转到光下培养,叶盘生长状况都较差,随着诱导时间的延长,叶盘褐化率逐渐升高,培养30 d时叶盘大部分或全部褐化,不产生愈伤组织,出愈率为0。综合分析,最适宜诱导叶盘脱分化的培养基为MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ,在该培养基中出愈率高,且愈伤组织生命力旺盛,在适宜的愈伤组织再分化培养基中产生不定芽的效果最好。

2.4 不同培养基对愈伤组织再分化的影响

愈伤组织再分化产生不定芽的数量和质量因再分化培养基中植物生长调节剂组合的不同而不同。表3、图4显示,在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培养基中,愈伤组织的再分化率都高于80.0%,平均分化芽数也较多,但分化而来的芽基本表现出质地较脆、叶片细小、生长缓慢的玻璃化特征,不能正常生长,难以进行下一步的生根培养。在含有TDZ+2,4-D、6-BA+2,4-D的培养基中,愈伤组织在连续培养50 d时,基本都褐化,不分化不定芽。在含有1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基中,愈伤组织在连续继代后仍然保持愈伤状态,颜色为嫩黄色,质地较为疏松,不分化不定芽。愈伤组织在1/2 MS+6-BA+IBA培养基中培养18～25 d后,细胞变得更为紧密并产生绿色突起,30～40 d后形成不定芽,并产生根系。在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA的培养基中,愈伤组织再分化率最高,为91.0%,愈伤组织产生的不定芽形态健康、生长活跃且数量最多,因此选用该培养基作为绿色草莓愈伤组织再分化培养基。

表3 不同培养基对绿色草莓愈伤组织再分化的影响

A:愈伤组织接种在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基20 d的生长状况;B:愈伤组织接种在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA培养基50 d的生长状况;C:愈伤组织接种在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基50 d的生长状况;D:愈伤组织接种在1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基50 d的生长状况;E:愈伤组织接种在1/2 MS+2.0 mg/L TDZ+1.5 mg/L 2,4-D培养基50 d的生长状况;F:愈伤组织接种在1/2 MS+1.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA培养基50 d的生长状况;G:愈伤组织接种在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培养基50 d的生长状况。TDZ:噻苯隆;2,4-D:2,4-二氯苯氧乙酸;IBA:吲哚丁酸;6-BA:6-苄氨基嘌呤;NAA:萘乙酸。

2.5 生根培养和炼苗移栽

绿色草莓生根培养结果(图5)表明,不同培养基对试管苗生根率的影响无明显差异,生根率均为100%,但对试管苗生根量和生根长度的影响是不同的。适宜质量浓度的IBA能提高生根量,在IBA的质量浓度为0.1～0.2 mg/L时,随着IBA质量浓度的增加,根的数量和长度也增加。在添加0.2 mg/L IBA的基础上再添加0.1 mg/L IAA的培养基中,试管苗的根系比在仅含0.2 mg/L IBA培养基中的根系更为粗壮。但是,随着IAA、IBA质量浓度增加为0.3 mg/L、0.4 mg/L时,试管苗生根长度及生根量呈下降趋势,植株的长势也变弱。综合分析,1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培养基最有利于绿色草莓生根培养,在此培养基中,试管苗根系密集,主根和侧根生长势均衡,植株茎、叶健壮,整体长势较为旺盛。

从左到右所用培养基依次为1/2 MS+0.1 mg/L IBA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA、1/2 MS+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.1 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA、1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA。IBA:吲哚丁酸;IAA:吲哚乙酸。

对根系健壮、长势良好的绿色草莓试管苗进行炼苗,7 d后移栽于经高温灭菌的基质中,在温室培养30 d后,植株的成活率达到93.7%,并有匍匐茎萌发现象(图6)。

图6 炼苗与移栽

3 讨 论

3.1 不同培养基对绿色草莓初代培养与离体增殖的影响

在基础培养基中添加适量的细胞分裂素或生长素有利于初代试管苗的建立。韩如春等[15]发现,红颜草莓的茎尖在添加6-BA和NAA的培养基中能获得较高的成活率和诱芽率。6-BA与NAA或IBA或IAA组合使用都对红颜草莓再生不定芽有促进作用,其中6-BA与NAA搭配效果最好[16]。本研究发现,相较于MS、MS+0.5 mg/L 6-BA,茎尖在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3培养基中的成活率更高,且成活的茎尖长势更好,因而该培养基更适用于绿色草莓初代培养。

不同草莓品种增殖培养阶段使用的最适植物生长调节剂类型和比例存在差异。6-BA在减弱根尖优势、刺激新芽萌发方面比其他植物生长调节剂的效果更好[17]。肖君泽等[18]发现,章姬草莓的增殖系数随着培养基中添加6-BA质量浓度的增加而增加。白雪公主、红颜草莓的最佳增殖培养基均使用6-BA[19-20]。本研究也同样发现,绿色草莓增殖系数主要受6-BA质量浓度影响,但随着增殖系数的不断提高,会出现幼苗生长势变弱、叶片黄化的现象。6-BA与IAA或IBA或GA3配合使用能缓和单独使用6-BA对绿色草莓过度增殖产生植株长势变弱的极端影响;当培养基中添加6-BA和IBA的质量浓度分别为0.1 mg/L、0.2 mg/L时,绿色草莓的增殖效果最好,增殖系数为6.4,所诱导产生的草莓苗不但健壮,而且叶片鲜绿。

3.2 不同培养条件对绿色草莓叶盘脱分化的影响

以草莓不同部位为外植体诱导产生不定芽的研究已有报道,在不同的外植体中,叶盘的再生率最高[21]。由于叶片来源广泛、易于处理,草莓叶片已成为离体再生的最佳材料。以叶盘为再生外植体时,其放置方式对不定芽再生率和不定芽质量有一定影响,研究发现,Redcoat[22]、红颊[23]等多个草莓品种叶盘背面接触培养基时的再生率更高。但也有研究发现,叶盘背面接触培养基时产生的再生芽不如其他放置方式产生的再生芽健壮,叶盘放置方式对再生效果的影响还有待进一步研究[24]。目前常用的基本培养基有MS、1/2 MS、改良MS等,MS基本培养基中各元素的比例合适,缓冲性强,具有高效的不定芽诱导性,可用于多种植物的各类组织培养[25-26]。草莓离体再生培养前期需要暗培养,直接进行光照或在不适宜光强下培养可能导致无愈伤组织形成[27]。本研究以MS为基础培养基,对绿色草莓叶龄为30 d的叶盘进行脱分化处理,采用叶盘背面接触培养基的方式进行培养,在连续暗培养24 d后叶盘伤口处产生白色愈伤组织。

控制植物生长调节剂的使用可以调节细胞的分化方向,一般来说,细胞分裂素与生长素的比值高有利于诱导不定芽的产生,细胞分裂素与生长素的比值低则有利于愈伤组织的诱导和根的形成[28-31]。TDZ对愈伤组织的诱导、不定芽再生有不同程度的影响,可以促进一些很难发生器官再生的木本植物的体外再生,如苹果、梨[32-34]。有研究结果表明,TDZ的使用对草莓试管苗再生的效果显著[35-36]。本研究发现,TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)与IBA(0.1 mg/L、0.2 mg/L)组合使用时,出愈率为0。在培养基中添加2,4-D(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0mg/L)和TDZ(1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)时都能使叶盘产生愈伤组织,出愈率都高达100%,其中在MS+1.5 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L TDZ培养基中产生的愈伤组织在适宜再分化培养基中的再分化效果最好。

3.3 不同培养基对绿色草莓愈伤组织再分化的影响

草莓再生不定芽诱导阶段常用的细胞分裂素是6-BA和TDZ[37]。张志宏等[38]认为TDZ诱导Tudla草莓再生的效果优于6-BA。据报道,在草莓组织培养中单独使用TDZ或与2,4-D、IBA联合使用能有效诱导不定芽再生[5,39-40]。也有研究发现,愈伤组织在6-BA+IBA培养基中的再分化率比在其他激素组合的培养基中的再分化率更高[41]。本研究发现愈伤组织在含有TDZ+2,4-D的培养基中不能进一步分化;在含有TDZ+NAA、TDZ+IBA的培养基中,愈伤组织再分化产生的不定芽玻璃化严重,难以进行生根诱导,不能达到理想的再生效果;在1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基中,愈伤组织在连续继代培养后始终保持疏松的愈伤组织状态;6-BA与IBA组合能有效促使绿色草莓愈伤组织分化出不定芽,其中最适组合为1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA,在该培养基中愈伤组织再分化率为91.0%,平均分化芽数为46.2个,再生芽比较健壮。

3.4 不同培养基对绿色草莓生根的影响

植物生根培养一般采用MS、1/2 MS为基本培养基,同时添加或不添加低质量浓度的生长素,如IAA、IBA等。在草莓生根培养基中添加低质量浓度的生长素测试中,单独添加IBA、IAA、NAA均可进行生根诱导[42-45]。红颜草莓最佳生根培养基为添加IBA的1/2 MS培养基[20]。梁贵秋等[46]发现,IBA、IAA分别有利于草莓组培苗侧根、主根的生长,同时使用IBA和IAA可以取得良好的不定根诱导效果。本研究发现适宜质量浓度的IBA、IAA均能诱导再生芽生根,但生长素质量浓度过高时根的生长势失衡表现为短而粗或细而长。在IBA与IAA组合使用的培养基中,绿色草莓的根系更为密集,生根形态更自然、更正常,茎、叶长势旺盛,有利于驯化移栽或开展其他与根系相关的试验。综合分析,绿色草莓在1/2 MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L IAA培养基中的生根效果最好。