基于SIRT3/MnSOD信号通路探讨健脾调脂方对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

王 新,付 蓉,覃 余,高代材

(1. 贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025;2. 贵州中医药大学第二附属医院,贵州 贵阳 550001;3. 盐源县中医医院,四川 盐源 615000)

心力衰竭是由于心脏结构或功能障碍导致心室射血和充盈功能受损而出现心功能不全的临床综合征[1]。近年来随着人口老龄化加剧,心力衰竭的发病率在逐渐增高,在≥25岁的中国人群中,心力衰竭患者达1 210万;在≥35岁的中国人群中,心力衰竭患病率为1.3%;25～64岁、65～79岁和≥80岁人群心力衰竭患病率分别为0.57%,3.86%和7.55%[2]。心肌纤维化是高血压心脏病、冠心病、心肌病等心脏疾病向心力衰竭进展的必然过程,其发生在心脏损伤的早期,并贯穿心脏损伤的始终,是心力衰竭极为重要的病理生理过程。在心肌纤维化进展过程中,沉默调节蛋白3(SIRT3)可通过抗氧化应激,抑制肌成纤维细胞分化,从而抑制心肌纤维化,延缓心力衰竭的发生发展[3-4]。锰超氧化物歧化酶 (MnSOD)具有抗氧化作用,SIRT3可以直接通过去乙酰化MnSOD从而增强 MnSOD 的抗氧化能力[5]。中医学根据心肌纤维化的临床表现多将其归于“心悸”“胸痹”等范畴,病机为本虚标实、久病入络,本虚为阳气亏虚,标实为痰浊、瘀血,其中血瘀是心肌纤维化病变过程中的重要病机和病理产物[6]。贵州中医药大学第二附属医院心血管内科付蓉主任医师拟定的验方——健脾调脂方具有健脾化湿、活血化瘀降浊之功[7],本研究探讨了该方对心力衰竭心肌纤维化及SIRT3/MnSOD信号通路的影响,以明确其作用及机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 70只SPF级雄性SD大鼠,体重200～220 g,由贵州中医药大学云岩校区实验动物方提供,实验动物生产许可证号:SCXK(黔)2021-0003。大鼠在SPF级实验动物设施中饲养,食水充足,温湿度适应(温度20～24 ℃,湿度40%～60%),自由取食,适应饲养1周。动物使用严格遵照贵州中医药大学动物伦理管理委员会要求。

1.2主要药物与试剂 健脾调脂方(白术15 g、茯苓15 g、草决明12 g、泽泻12 g、半夏12 g、山楂9 g、丹参9 g)制剂由贵州中医药大学第二附属医院药剂科提供(黔药制字Z20100014);卡托普利片(中美上海施贵宝制药有限公司,国药准字H31022986,规格:25 mg/片);阿霉素(上海展云化工有限公司,批号:20150412)。Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)抗体(美国Affinity公司,批号:AF7001),Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)抗体(美国Affinity公司,批号:AF5457),SIRT3抗体(美国Affinity公司,批号:AF5135),MnSOD抗体(美国Affinity公司,批号:AF5144),β-actin抗体(美国Affinity公司,批号:#AF7018),蛋白提取液(北京MDL公司,批号:MDL91201),蛋白酶抑制剂(北京MDL公司,批号:MD912893),BCA蛋白浓度测定kit(北京MDL公司,批号:MD913053),SDS-PAGE预制胶套装kit(北京MDL公司,批号:MD911919),中等蛋白分子量Marker(美国Thermo公司,批号:26617)。

1.3主要仪器和耗材 电子显微镜(德国Leica仪器有限公司,DM3000),电热恒温水浴槽(上海一恒恒温设备厂,HWS-24),低温离心机(德国Sigma公司,3-30K),0.22 μm NC膜(美国Millipore公司,ISEQ00010),3MM滤纸(英国Whatman公司,3030861),脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司,TS-100),电泳仪(北京百晶生物技术有限公司,BG-subMIDI),SDS-PAGE电泳系统(美国BIO-Rad公司,Mini-PROTEAN®Tetra Cell with Mini Trans-Blot®Module And PowerPacTMUniversal Power Supply),凝胶成像系统(美国UPV公司,GelDoc-It310),ChemiDoc MP化学发光成像系统(美国BIO-Rad公司,170-8280)。

1.4实验方法 取10只大鼠作为正常组,其余60只大鼠采用阿霉素尾静脉注射方法建立心力衰竭心肌纤维化模型。造模方法:注射前24 h禁食水,每次注射阿霉素2.5 mg/kg,1次/周,连续注射6周后,由专门超声技师通过彩色多普勒超声心脏探头检测验证大鼠造模结果,以左心室射血分数(LVEF)<50%提示心力衰竭造模成功,然后随机选取10只大鼠进行心肌组织病理切片HE染色证实其具有心肌纤维化病理学特征提示心肌纤维化造模成功。造模成功后,将存活大鼠随机分为模型组、卡托普利组、健脾调脂方低剂量组、健脾调脂方中剂量组、健脾调脂方高剂量组,每组10只。根据《中医科研设计与统计学》中人与动物体表面积比率换算法,参照临床70 kg体重成年患者每天服药量,卡托普利组给予卡托普利2.6 mg/kg灌胃,健脾调脂方低、中、高剂量组分别给予健脾调脂方4.38 g/kg、8.75 g/kg、17.75 g/kg灌胃,正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃,均1次/d,连续6周,期间每周末称重换算给药剂量。

1.5观察指标及方法

1.5.1心功能 末次灌胃40 min后,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,备皮,充分暴露胸部,将大鼠仰卧位固定。采用M型超声心动图连续检测3个心动周期,观察并记录左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、LVEF、左心室短轴缩短率 (LVFS),评估大鼠心功能。

1.5.2心肌组织病理学形态及纤维化情况 剖取大鼠左心室的心肌组织,4%多聚甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,制作4～6 μm厚切片,分别进行HE及Masson染色,光学显微镜下观察,计算心肌胶原容积分数(胶原阳性蓝色面积/组织总面积×100%)。

1.5.3心肌组织中胶原蛋白及SIRT3、MnSOD蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取左室心肌组织,PBS匀浆,裂解液裂解,4 ℃下12 000 r/min离心30 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度。样品加至凝胶孔,电压80 V进行电泳;电泳结束后,将蛋白条带转印至NC膜,接通电源,恒压状态下,120 V转膜1.5 h;转膜结束后,室温下TBST洗膜3次,后置于封闭液中封闭2 h;一抗4 ℃孵育过夜;二抗37 ℃孵育1 h;ECL显色,将膜放入化学发光成像系统成像;结果采用Image J软件测定灰度值,进行半定量分析,重复3次。

1.5.4心肌组织中胶原蛋白及SIRT3、MnSOD mRNA表达情况 采用RT-qPCR法检测:取左室心肌组织,加1 mL TRIzol研磨,转移至1. 5 mL EP管。测定总RNA浓度,按照试剂盒说明书反向转录成cDNA。按2 μL cDNA、10 μL PCR mix、1 μL primer F、1 μL primerR、6 μL ddH2O建立RT-qPCR反应体系,体系混匀后,瞬离一下,置于荧光定量PCR仪上按照相应反应条件进行反应,最后采用2-ΔΔCT法分析。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。

表1 引物序列

1.6统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件分析数据,符合正态分布方差齐的数据多组间比较采用

单因素方差分析,其多重比较采用LSD检验;不符合正态分布或方差不齐的数据采用非参数检验。使用GraphPad Prism7.0软件绘制柱状图。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1各组大鼠心功能比较 与正常组比较,模型组大鼠LVIDd、LVIDs均明显增加(P均<0.05),LVEF、LVFS均明显降低(P均<0.05);与模型组比较, 卡托普利组和健脾调脂方各组LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS均明显改善(P均<0.05), 健脾调脂方各剂量组上述4项指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但健脾调脂方高剂量组改善相对更明显。见图1。

图1 正常组和心力衰竭各组大鼠心功能指标

2.2各组大鼠心肌组织病理学形态 正常组大鼠心肌组织正常;模型组大鼠心肌细胞间隙扩大,大量炎症细胞聚集,细胞坏死,心肌纤维断裂、出血;与模型组比较,健脾调脂方低剂量组大鼠心肌组织病理改变减轻,但依旧可见炎症细胞聚集;健脾调脂方中、高剂量组和卡托普利组大鼠细胞坏死较少,组织肿胀、心肌纤维断裂等情况显著减轻,但依旧可见少量出血。见图2。

图2 正常组和心力衰竭各组大鼠心肌组织病理学形态(HE染色,×100)

2.3各组大鼠心肌组织纤维化情况 正常组心肌

纤维染成红色,心肌胶原容积分数为7.53%;模型组纤维胶原沉积,胶原纤维染成蓝色,心肌胶原容积分数为30.09%,明显高于正常组(P<0.05);卡托普利组和健脾调脂方低、中、高剂量组纤维化程度较轻,心肌胶原容积分数分别为16.45%,24.07%,13.82%,14.45%,均明显低于模型组(P均<0.05)。见图3。

图3 正常组和心力衰竭各组大鼠心肌组织纤维化情况(Masson染色,×100)

2.4各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD蛋白表达情况 与正常组比较,模型组大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相对表达量均明显增高(P均<0.05),SIRT3、MnSOD蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组比较, 卡托普利组和健脾调脂方各组大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),SIRT3、MnSOD蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。见图4。

图4 正常组和心力衰竭各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD蛋白表达情况

2.5各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD mRNA表达情况 与正常组比较,模型组大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA相对表达量均明显增高(P均<0.05),SIRT3、MnSOD mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05);与模型组比较,卡托普利组和健脾调脂方中、高剂量组大鼠Collagen Ⅰ mRNA相对表达量及各药物组大鼠Collagen Ⅲ mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05),卡托普利组大鼠SIRT3、MnSOD mRNA相对表达量和健脾调脂方中、高剂量组大鼠SIRT3 mRNA相对表达量及健脾调脂方高剂量组大鼠MnSOD mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)。见图5。

图5 正常组和心力衰竭各组大鼠心肌组织中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD mRNA表达情况

3 讨 论

目前研究认为,心肌纤维化是促进病理性心脏重塑的关键因素,而心脏重塑在心力衰竭心脏功能逐渐恶化中起关键作用[8-9]。心肌纤维化是指细胞外基质产生和降解不平衡,大量细胞外基质沉积导致心肌组织顺应性下降,并影响心排血量,最终导致心功能不全的一种病理改变[10]。心肌纤维化是各种心脏疾病的病理基础,也是心功能障碍的重要诱因,心肌纤维化的程度与心脏疾病的预后密切相关[8]。因此,抑制心脏重塑、改善心肌纤维化有望改善心力衰竭预后。

中医药通过软坚散结法、祛痰化瘀法、通络法等辨证论治心肌纤维化均有一定效果[11-13]。健脾调脂方既可消痰饮、化湿浊,又可活血化瘀,前期研究证实该方可改善急性冠脉综合征患者血管内皮功能[7],但其对心肌纤维化是否有影响尚不明确,为此课题组进行了相关实验研究。结果显示,大鼠尾静脉注射阿霉素可成功复制心力衰竭心肌纤维化模型;给予不同剂量的健脾调脂方干预后,大鼠LVIDd、LVIDs均缩短,LVEF、LVFS均升高,心肌胶原容积分数及心肌组织中Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ蛋白及mRNA表达量降低,心肌细胞坏死较少,组织肿胀、心肌纤维断裂等情况显著减轻,其中高剂量健脾调脂方干预作用更明显,说明健脾调脂方可在一定程度上抑制心肌纤维化,改善心功能,且与剂量有一定关系。

Sirtuins 家族是一组依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶,可以去乙酰化组蛋白和非组蛋白,能改变部分蛋白的功能,还能够消除异常化学反应中的乙酰基团,去乙酰化赖氨酸残基,释放尼克酰胺和乙酰化底物,它们与心血管疾病的病理生理息息相关[14]。SIRT3是一种存在于线粒体基质中的可溶性蛋白,是Sirtuins家族成员之一,在氧化应激和脂质代谢中具有不可或缺的作用,且在机体内SIRT3几乎参与所有的细胞代谢信号通路调节[15]。MnSOD位于线粒体内,其主要通过清除自由基来保护机体免受氧化损伤,SIRT3表达上调可促进MnSOD表达,从而提高机体的抗氧化能力,减轻氧化应激[16]。本实验结果显示,中、高剂量健脾调脂方可上调SIRT3、MnSOD的表达,结合既往研究推测健脾调脂方可能通过上调SIRT3表达从而促进MnSOD表达,产生抗氧化作用,抑制心肌纤维化。

综上所述,健脾调脂方能有效抑制心力衰竭进程中心肌组织中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达,减轻心肌纤维化程度,其作用机制可能与激活SIRT3/MnSOD信号通路,减轻氧化应激有关。但健脾调脂方中具体是哪一种成分起作用,是否还有其他通路参与,有待进一步深入研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。