基于GEO数据库和生物信息学方法分析水蛭治疗心肌梗死的差异靶基因和信号通路*

卢丽颖，郑景辉，徐文华，杨文娜，李丽娟

广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011

水蛭是我国传统的名贵中药材，是经典的活血化瘀类虫药。2015年版《中华人民共和国药典》［1］记载：水蛭具有破血通经、逐瘀消癥的功效，常用于治疗血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌扑损伤等。张锡纯描述水蛭为“水蛭破瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而瘀血默消于无形，真良药也”［2］。名老中医杨牧祥认为水蛭祛瘀之力较强，且破瘀血而不伤新血，故常以水蛭治疗病机属瘀血阻滞证患者［3］。颜德馨老中医也常以水蛭一药祛除瘀血，治疗疑难痼疾［4］。

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于动脉内壁形成斑块，导致流向心脏的血流减少，并因供氧不足而导致心肌坏死。各类心血管疾病都易发生MI。目前，心血管疾病已成为导致我国城乡居民总死亡率升高的主要原因之一，并已成为重大的公共卫生问题［5］。尽管临床已有针对MI的指南推荐相关疗法，但患者出院后复发的风险仍在增加［6］。MI属中医学“真心痛”“胸痹”等范畴，常合并心悸、心衰等，以血瘀、痰浊两种证型最常见［7］。水蛭作为传统的活血化瘀药，常用于治疗心血管疾病。生物信息学分析是运用新的高通量分子生物技术收集并分析大量组学数据，进而在数据研究基础上对生物医学问题进行研究，可用于探究中药治疗疾病的分子机制及与相关基因之间的关联性。本研究基于基因表达综合数据库（gene expression omnibus，GEO）和网络药理学，分析MI差异表达的靶点，并分析水蛭的主要活性成分及作用靶点，探究其治疗MI的作用机制，为水蛭现代药理研究和临床运用提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 Ml差异靶基因筛选通过GEO数据库筛选MI的差异靶基因，在NCBI网页（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下拉框中选择“GEO DataSets”，并在检索框中输入“Myocardial infarction”，限定Manage Filters为“Homo sapiens”，Entry type为“Series”。阅读题目和摘要，筛选与本研究相关的内容，并用GEO2R在线工具进行差异靶基因筛选。差异靶基因筛选条件以P＜0.05（-logP=1.301），|logFC|＞1为标准。

1.2 水蛭活性化合物及其靶基因筛选通过中医药综合数据库（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）（http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）检索与水蛭相关的化合物。以“SHUI ZHI”为检索词，检索与水蛭相关的化合物，并将检索得到的化合物上传至比较毒理基因组学数据库（comparative toxicogenomics database，CTD）（http：//ctdbase.org/）、Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、BATMAN数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），筛选水蛭活性化合物相关靶点。

1.3 水蛭治疗Ml的差异靶基因分析及关键基因筛选将水蛭活性化合物靶点与MI差异表达的靶点进行映射，并构建韦恩图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）。存在交集的共同靶点可能是水蛭治疗MI差异表达的靶点。将得到的差异表达靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），将研究物种限定为“Homo sapiens”，设定蛋白之间相互作用的结合分数≥0.4，进行蛋白-蛋白互作网络（proteinprotein interactions，PPI）分析。使用Cytoscape软件对PPI图进行可视化分析，并使用MCODE插件分析PPI图中的共表达基因，使用Cytohubba插件中MCC算法筛选连通度最大的前10个基因作为关键基因。

1.4 基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析将核心靶基因导入基因功能注释数据库（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID） 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）对差异表达的靶点进行生物信息学分析，用Gene Symbol格式将水蛭治疗MI差异表达的靶点导入DAVID 6.8数据库中进行GO和KEGG富集分析。GO分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）。GO和KEGG富集分析的筛选条件为P＜0.05。

2 结果

2.1 Ml差异靶基因通过GEO数据库共检索得到281个潜在相关系列，经阅读题目和摘要，筛选得到2个与MI相关系列（GSE29111、GSE83500），104062个基因。使用GEO2R在线工具进行差异靶基因筛选，根据筛选标准（P＜0.05，|logFC|＞1）共筛选出794个差异基因，包括386个下调基因，408个上调基因，去除重复靶点后获得770个唯一靶点。见图1。

图1 MI差异基因表达谱火山图

2.2 水蛭的活性化合物及其靶基因通过检索TCMID数据库，共检索到水蛭相关化合物35个，11个未知化合物，最终得到有效化合物成分24个，获取803个靶点，去除重复靶点后共获得518个相关靶点。见表1。

表1 水蛭化合物及其相关靶点来源

2.3 水蛭治疗Ml的差异基因分析及关键基因筛选将水蛭化学成分靶点与MI差异表达靶点进行映射，并构建韦恩图，见图2。共得到28个水蛭治疗MI差异表达的基因，分别是MMP2、ADAM12、IGF1、MAOA、EDNRA、PTGER1、FGFR2、AMY2A、ESR1、VEGFA、AREG、CA12、CPA1、PPARA、AMY1A、MAOB、PPM1B、Akt2、EGFR、KDM4C、THBS1、MYCN、CFTR、NR1H4、TYR、PDGFRA、ESR2、FGF23。将28个差异表达的基因导入STRING数据库进行PPI分析，并用Cytoscape软件进行可视化分析，见图3。MCODE插件分析得到2个基因簇群，第一个簇群包括6节点，12条边；第二个簇群包括5个节点，6条边。利用Cytohubba插件中的MCC算法筛选出10个关键基因，分别是：VEGFA、Akt2、EGFR、AREG、PDGFRA、ESR1、MMP2、FGFR2、IGF1、MYCN，其中有4个基因呈上调趋势，6个基因呈下调趋势，见表2。关键基因存在相互作用，见图4—5。

表2 关键基因信息

图2 水蛭化学成分靶点与MI差异表达靶点韦恩图

图3 水蛭治疗MI的差异靶基因PPI图

图4 基因簇群图

图5 关键基因PPT网络图

2.4 GO和KEGG富集分析结果将28个差异靶基因导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，共得到25个BP，包括细胞增殖正调控、从RNA聚合酶ll启动子转录的正调控、细胞迁移正调控、转录正调控，DNA模板、磷脂酰肌醇介导的信号传导等；5个CC，包括质膜、细胞外空间、细胞外区域、细胞表面、血小板α颗粒内腔；27个MF，包括酶结合、蛋白质均二聚活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、磷脂酰肌醇-4，5-双磷酸3-激酶活性等。见表3。

表3 差异靶基因GO分析结果

经DAVID数据库的pathway功能分析共得到22个P＜0.05的KEGG，包括癌症的途径、Rap1信号通路、蛋白聚糖在癌症中、黑色素瘤、Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路，见表4。这些信号通路的P＜0.05，且富集了数量不等的基因，KEGG信号通路气泡图，见图6。

表4 KEGG富集分析通路

图6 KEGG富集分析气泡图

3 讨论

MI后发生心力衰竭仍然是致死或致残的主要原因之一。现代医学主要使用替罗非班、阿昔单抗等药物抑制血小板聚集，使用硝普钠、尼可地尔等药物扩张微血管［8］。尽管针对MI有很多治疗方案，但MI后心功能恢复及预防MI向心力衰竭转变的方法仍未完善。中医药治疗MI有显著疗效并能降低不良反应发生率。水蛭及其药物制剂已被广泛应用于各类心血管疾病中。卢健棋等［9］在不使用肝素、肠溶阿司匹林及其他抗凝药物的情况下对急性MI的患者予水蛭注射液进行治疗，发现与常规治疗组相比，早期应用水蛭注射液可明显提高冠脉再通率，降低病死率；安小军等［10］研究表明，在常规治疗的基础上，长期服用小剂量中药水蛭、葛根可提高陈旧性MI的治疗效果，并且无不良反应发生，对预防再发MI有重要意义。

本研究基于网络药理学技术分析出水蛭治疗MI的差异表达靶基因共28个，并利用Cytohubba中的MCC算法筛选出10个关键基因，分别是VEGFA、Akt2、EGFR、AREG、PDGFRA、ESR1、MMP2、FGFR2、IGF1、MYCN。其中ESR1、Akt2、PDGFRA、MYCN是上调靶点，EGFR、IGF1、VEGFA、MMP2、AREG、FGFR2是下调靶点，其中VEGFA、AREG为核心基因；EGFR是水蛭治疗MI的差异表达基因，是PPI网络中度值最大的基因，EGFR会驱动心血管疾病中的有害白细胞活性，阻断EGFR可以抑制适应性和先天免疫驱动的心血管炎症以及动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成［11］；VEGFA参与许多生理活动，与心血管疾病的发生息息相关，抑制VEGFA的异常表达对防治心血管疾病有重要意义［12］；AREG的表达能增加心肌缺血耐受性，减少MI范围，AREG的表达量在缺血性心脏病患者心肌组织中增加，同时AREG缺乏会加重心肌缺血再灌注损伤［13］。本研究结果提示VEGFA、AREG、EGFR等基因是水蛭治疗MI的重要靶点，后续的研究需要关注这些关键靶点。

GO分析结果可知水蛭治疗MI的这些差异基因主要存在于细胞外空间和细胞外区域、血小板α颗粒内腔、质膜等细胞成分。GO分析结果提示差异表达的基因有相似的生物学过程，具有协同作用的特点，水蛭治疗MI可能与成纤维细胞增殖、平滑肌细胞增殖的调控、对缺氧反应、磷脂酰肌醇介导的信号传导这些生物功能密切相关。成纤维细胞是心肌纤维化的重要效应细胞［14］，血管平滑肌细胞可以减轻缺血再灌注损伤，改善MI后心功能［15］。与磷脂酰肌醇介导的信号传导有关的通路主要有PI3K-Akt信号通路，PI3K和下游效应物Akt属于信号转导酶的保守家族，参与调节细胞活化、炎症反应和凋亡［16］。GO分析提示水蛭治疗MI在不同的细胞成分中通过干预多种生物功能达到治疗效果。

KEGG分析结果提示水蛭治疗MI的差异表达基因通过多个信号通路发挥作用。Rap1信号通路对于血管形成和血管生成有重要意义，Rap1通常与PKA信号共同调节通透性和细胞收缩性［17］。Rap1对于防止循环中血小板过早活化以及血管损伤部位的止血作用至关重要［18］。RAS信号通路的激活参与动脉粥样硬化的形成［19］。RAS和PIK3CA信号对细胞增殖、分化和存活有广泛影响，RAS或PIK3CA途径影响酪氨酸激酶受体信号使血管异常突变［20］。RAS/MAPK通路以生长因子和小分子的形式将细胞外输入转导到细胞内环境，其失调是癌症的主要原因之一。此外，在肥厚型心肌病中RAS/MAPK信号表达增加［21］。HIF-1是一种转录因子，作为氧稳态的主要调节因子发挥作用［22］。HIF-1通过调节血管生成和血管重塑来控制氧气输送，通过调节葡萄糖代谢和氧化还原稳态来控制氧气利用，在压力超负荷的代偿性心肌肥大过程中，心肌细胞中的HIF-1活性能维持氧的稳态［23］。

综上所述，本研究通过GEO数据库和生物信息学研究发现，水蛭治疗MI的差异基因有28个，包括VEGFA、AREG、EGFR等，其作用机制可能与调控Rap1、PI3K-Akt、Ras、MAPK、HIF-1等信号通路有关。